Όνομα:Παπασαράντη Άιντα Αριθμός μητρόου :4956 Υπεύθυνη καθηγήτρια : Μαρία Φράγκου Μάθημα :Βιοτεχνολογία

Τι είναι οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία(ALL); Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία είναι μια μορφή λευχαιμίας, ή καρκίνου των λευκών αιμοσφαιρίων που χαρακτηρίζεται από υπέρμετρο αριθμό λεμφοβλαστών.Τα ανώριμα λευκά αιμοσφαίρια πολλαπλασιάζονται συνεχώς και παρατηρείται αυξημένη παραγωγή στο μυελό των οστών. Η ALL προκαλεί βλάβες και θάνατο επειδή:  παραγκωνίζει τα φυσιολογικά κύτταρα στο μυελό των οστών  κάνει μεταστάσεις σε άλλα όργανα.

Οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία Εδώ τα βλαστικά λευχαιμικά στοιχεία δεν εμφανίζουν τους ενζυματικούς χαρακτήρες των μυελικών κυτταρικών στοιχείων και είναι αρνητικά στην μυελοϋπεροξειδάση και στην χλωροοξεική εστεράση. Εμφανίζουν ανοσοϊστοχημικούς δείκτες λεμφοειδών κυττάρων. Αποτελούν ετερογενή ομάδα.

Μεθόδοι Δείγματα λήφθηκαν από ασθενείς με ETV6-RUNX1 σύντηξη από διάφορα νοσοκομεία της Μεγάλης Βρετανίας. Πραγματοποιήθηκε η μεσόφαση FISH Σε κάθε περίπτωση, τουλάχιστον 200 πυρήνες ταξινομήθηκαν για την παρουσία του γονίδιου ETV6-RUNX1 σύντηξης, σε συνδυασμό με τη διαγραφή των ETV6, RUNX1, PAX5, CDKN2A,BTG1 και 11q, καθώς και αύξηση των RUNX1 και επικάλυψη του ETV6- RUNX1 γονίδιο σύντηξης. NOD / SCID ποντίκια IL2Rγ που στερούνται οποιαδήποτε Β, Τ και φυσικούς φονείς κυττάρα εκτράφηκαν και διατηρήθηκαν υπό στείρες συνθήκες. Η μεταμόσχευση των κυττάρων ήταν με ενέσεις σε εβδομάδες, μετά απο ακτινοβόληση 250cGy. Η εμφύτευση εκτιμήθηκε σε 5-10 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση,και εξετάστηκε εάν> 2% των ποντικιών σκοτώθηκαν.

Τα ανεκτημένα κύτταρα του μυελού των οστών χρωματίστηκαν με CD45 για τον εντοπισμό του ανθρώπινου εμφυτεύματος. Από 2x10 2 μέχρι 2x10 5 ανθρώπινων κυττάρων εμφυτεύτηκε μέσα από ενδοκνήμια ένεση.

Συμπτώματα

Α,Αρχιτεκτονική με τρεις κλώνους. Εκπρόσωπος FISH στην εικόνα δεξιά και παραδείγματα για κάθε υπόκλωνο. B, Μέτρια περίπλοκη αρχιτεκτονική με πέντε υπόκλωνους. C, περίπλοκη αρχιτεκτονική με οκτώ υποκλώνους. PAX5 διαγραφές εμφανίζονται ανεξάρτητα σε δύο ξεχωριστoύς υπόκλωνους. Τα βέλη δείχνουν τον πιθανό προγονικό παράγωγο του υπόκλωνου, διακεκομμένα βέλη δείχνουν την πιθανή προέλευση των υπόκλωνων. F, το κίτρινο σήμα, το ETV6-RUNX1 το οποίο είναι το γονίδιο σύντηξης, 2 RUNX1, δύο κόκκινα σήματα (ένα μεγάλο και ένα μικρό), που αντιστοιχεί σε μια κανονική RUNX1 αλληλόμορφο, και ένα μικρό που παράγεται από τη διαταραχή της φυσιολογικής RUNX1 αλληλόμορφου και εμπλέκεται στη σύντηξη του γονίδιου; ETV6, πράσινο σήμα που αντιστοιχεί στην κανονική (αμετάτρεπτο) ETV6 αλληλόμορφο; PAX5 (ή CDKN2A), ροζ σήμα. Παραδείγματα από υπόκλωνη αρχιτεκτονική ALL.

Αλλαγες στην κλωνική αρχιτεκτονική της ALL Α, ETV6-RUNX1 σύντηξη και ταυτόχρονη διαγραφή των CDKN2A και BTG1 σε βλαστικά κυττάρά κατά τη διάγνωση της ALL,στο μυελό των οστών,τα δείγματα λαμβάνονται 7 μήνες νωρίτερα κατά τη διάρκεια μιας προ- λευχαιμικής απλαστικής φάσης.Δεν πραγματοποιούνται διαγραφές της CDKN2A, αν και υπήρχαν αρκετές άλλες ανωμαλίες του αριθμού των αντιγράφων, συμπεριλαμβανομένων των 11q, 15q, 5q και BTG1 διαγραφής των γονιδίων καθώς και αύξηση των Xq. Στη διάγνωση της ALL περίπου 7 μήνες αργότερα, ο υπερισχύων κλώνος περιείχε ομόζυγη διαγραφή της CDKN2A. Μόνο οι κλώνοι που έχουν αποκοπεί εμφανίζονται. Απεικονίζονται τεσσάρα χρωμάτα FISH για κλώνους κατά τη διάρκεια της απλαστικής λευχαιμικής φάσης(εμφανίζεται στο κάτω μέρος). b, Ένα παράδειγμα της υποτροπής που προέρχεται από κατώτερους κλώνους κατά τη διάγνωση. R, πιθανόν προέρχεται από κλώνους της υποτροπής.

Η αρχιτεκτονική των κλώνων σε μια δεύτερη περίπτωση της ALL με προ-λευχαιμική απλαστική φάση Λαμβάνεται δείγμα από το μυελό των οστών 4 μήνες νωρίτερα κατά τη διάρκεια μιας προ-λευχαιμικής απλαστικής φάσης. Η ETV6-RUNX1 σύντηξη και ταυτόχρονα η διαγραφή του TBL1XR1 γονιδίου και του ETV6 στα βλαστικά κυττάρα κατά τη διάγνωση της ALL έδειξε τη διαφοροποίηση και την κλωνική εξέλιξη των τριών κλώνων που υπάρχουν στην απλαστική φάση. Κατά τη διάρκεια της προ-λευχαιμικής απλαστικής φάσης ο κυρίαρχος κλώνος περιέχει τη διαγραφή του γονιδίου TBL1XR1,το αμετακίνητο ETV6 ήταν παρών στο 62% του συνολικού ETV6-RUNX1 σύντηξης των θετικών κυττάρων, αυξάνοντας το σε 93% τη στιγμή της διάγνωσης της ALL. Η υπο-κλώνος η οποία διατηρεί αμετακίνητο τοETV6 με τη διαγραφή του γονιδίου TBL1XR1 μειώθηκε από 17% σε 4,5%. Οι τρείς εικόνες FISH των κυρίαρχων κλώνων κατά τη διάρκεια της λευχαιμικής απλαστικής φάσης εμφανίζονται στο κέντρο.

H ποικιλομορφία των υπόκλωνων πληθυσμών(ροή) (a) Αποψυχθέντα μονοπύρηνα κύτταρα από έναν ασθενή ταξινομήθηκαν,ανάλογα με τη ροή,για τους υψηλούς(hi) και χαμηλούς (lo) CD34πληθυσμούς (αριστερή πλευρά), κα θώς και τον υψηλό (hi)CD20 και χαμηλό(lo) CD20 πληθυσμό. (δεξιά πλευρά). Η κλωνική αρχιτεκτωνική των αδιαχώριστων κυττάρων φαίνεται επάνω. (β) Οι πληθυσμοί από την ΄΄ασυσκεύαστη’’ κλωνική, των αδιαχώριστων κυττάρων από έναν ασθενή(αριστερή πλευρά) και από την ταξινομημένη ροή του CD CD38-ν lowCD19 πληθυσμού από τον ίδιο ασθενή (δεξιά πλευρά).

Γενετική των πολλαπλασιαστικών κυττάρων σε NOD/SCID/IL2γnull ποντίκια. (a) πριν από την ένεση (b) μετά την πρώτη μεταμόσχευση (c) μετά τη δευτεροβάθμια μεταμόσχευση Εικόνες FISH από τους τέσσεροις υπο-κλωνους (B-E)και το υποτιθέμενο προ- λευχαιμικό κύτταρο(Α) στην κορυφή (a). Το SNP προφιλ των διαγνωστικών κύτταρων (d) και τη δευτερογενή μεταμόσχευση (e) του DNA. Και στα δύο δείγματα (d) και (e) έχουμε διαγράψει την 12p13.33-p12.3 περιοχή (συμπεριλαμβανομένων των ETV6),έχουμε υπόκλωνη απώλεια του CDKN2A, και υπόκλωνο κέρδος του χρωμοσώματος 21. Τα δύο διαγνωστικά δείγματα (d) και η αναγεννημένη (e) είχαν διαγραφή στο 5 ‘άκρο τωνPAX5. Αυτό επιβεβαιώθηκε με FISH αφού το PAX5 αντικαταστάθηκε από το BAC.

Η αναγέννηση των λευχαιμικών κυττάρων σε NOD/SCID/IL2γnull ποντίκια. (α) May Grunwald-Giemsa χρώση των BM κυττάρων από ένα NOD/SCID ποντίκι. Έχουμε και λευχαιμικά βλαστικά κύτταρα εκτός από του ποντικιού. (β) Πάνω βλέπουμε ένα διευρυμένο σπλήνα ποντικιού με λευχαιμική εμφύτευση,και κάτω ένα μεταμοσχευμένο σπλήνα. (γ) ΤοFACS dotplot δείχνει ανθρώπινα CD45+ κύτταρα τα οποία είχαν εμφυτευθεί σε ποντίκι. (δ) Συνδυασμένο ανοσοφαινότυπο από CD45 (μπλε).FISH για την ETV6-RUNX1 γονιδιακή σύντηξη που αφορά τον πληθυσμό των κυττάρων που συλλέγονται από το μυελό των οστών με λευχαιμική αναγέννηση. Στην ALL λιγότερο από το 99% των CD45 + (ανθρώπινων) κυττάρων ήταν θετικά στο γονίδιο σύντηξης. CD45/AMCA - μπλε. ETV6 - πράσινο, RUNX1 - κόκκινο, ETV6-RUNX1 γονίδιο σύντηξης - κίτρινο (βέλη).

FISH για το αναγνωρισμένο CNA από την SNP στην αναγεννημένη λευχαιμί α in vivo. (a) Εικόνα FISH των λευχαιμικών κυττάρων που δείχνει ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 22 (βέλη). Αυτή η ανωμαλία ήταν ανιχνεύσιμη στο διαγνωστικό δείγμα, αλλά τώρα υπάρχει στο 74% των κυττάρων με το γονότυπο 1 ETV6-RUNX1 σύντηξη, 3 RUNX1, 1 ETV6. (b) Εικόνα FISHτων λευχαιμικών κυττάρων που παρουσιάζει μια αύξηση της 13q31.3- q34 σε ένα κυρίαρχουπο-κλώνος (βέλη). Αυτή η ανωμαλία ήταν παρούσα σε ένα μικρό κλώνο (8%) στο διαγνωστικό δείγμα, αλλά υπάρχει στο 92% των κυττάρων με το γονότυπο 1 ETV6- RUNX1σύντηξη, 3 RUNX1,ETV6 στην αναγεννημένη λευχαιμία.

Ανάλυση του αριθμού αντιγράφων του λευχαιμικού γονιδιώματος, διάγνωση DNA από ασθενή (# 7)και αναγεννημένη λευχαιμί α μετά την ένεση σε NOD / SCID ποντίκια IL2gnul l. Οι μπλε γραμμές δηλώνουν το μεταλλαγμένο αντίγραφο (CNA) πέντε συνεχόμενων μονό- νουκλεοτιδίων πολυμορφισμού (SNP). Τρία κλάσματα του DNA έχουν εξεταστεί σύμφωνα με τις 500K SNP συστοιχίες,δηλαδή διάγνωση DNA, DNA από λευχαιμικά αναγεννημένα κύτταρα σε ποντίκια με μικτά κύτταρα και DNA από λευχαιμικά αναγεννημένα κύτταρα από CD34 + / CD19 + / CD38-/ χαμηλή κύτταρα. Οι διαγραφές των CDKN2A, BTLA και BTG1 είν αι κοινές μεταξύ των 3 εξεταζόμενων κλασμάτων, ενώ οι μεταβολές του ETV6,13q και του χρωμοσώματος 22 είναι χαρακτηριστικές μεταξύ των 3 τμημάτων.

Η FISH ελέγχει την ποιότητα του υβριδισμού. Οι εικόνες (a – d)FISH των κανονικών κυττάρων,δηλαδή το ETV6- RUNX1 γονίδιο σύντηξης είναι αρνητικό,είναι παρόντα στη διάγνωση 4 περιπτώσεων(από το μυελό των οστών ). Το ETV6-RUNX1 της ALL υβριδοποιούνται σε συνδυασμό με το CDKN2A (a, b)ή με το Pax6 ή (c, d). Σε κάθε περίπτωση υπάρχουν 2 αντίγραφα του ETV6 (πράσινο), 2 RUNX1 (κόκκινο) και 2 CDKN2A ή PAX5 (ροζ). Το ποσοστό των φυσιολογικών κυττάρων του με τα αναμενόμενα 2 σήματα για το CDKN2A και PAX5 ήταν % (μέσος όρος =99%).

Η FISH ελέχνει για διαφορές μεταξύ των φυσιολογικών και λευχαιμικών κυττάρων. (a-d)Οι εικόνες FISH ETV6-RUNX1 των θετικών ALL κυττάρων υβριδοποιούνται με ανιχνευτές για ‘’άσχετα’’ογκογονίδια (BCR και ABL), σε συνδυασμό μεCDKN2A ή PAX5, έτσι ώστε να προσδιορίστούν τα λευχαιμικά κύτταρα. Σε κάθε περίπτωση υπάρχουν 2 αντίγραφα της BCR (πράσινο), 2 ABL1 (κόκκινο) και 1CDKN2A ή PAX5 (ροζ). Μεταξύ % (μέσος όρος 98%) των κυττάρων είχαν το κανονικό σήμα (2 κόκκινες, 2 πράσινες) για την BCR και ABL.

Συμπεράσματα!! Η αρχιτεκτονική των κλώνων σε υποτροπή ήταν διαφορετική από ότι κατά τη διάγνωση.Η σύγκριση του γενετικού προφίλ των υποκλώνων επέτρεψε να προσδιοριστεί ο πιθανός υπόκλωνος που οδηγεί σε υποτροπή. Τα γενετικώς λευχαιμικά πολλαπλασιαστικά κύτταρα μπορούν να επιβιώσουν μετά τη χημειοθεραπεία με αποτέλεσμα την υποτροπή και την περαιτέρω διαφοροποίηση. Το αναγεννημένο γενετικό προφίλ της λευχαιμίας αποκάλυψε τη μεταβλητή δύναμη των γενετικών διακριτών υποκλώνων Αποδεικτικά στοιχεία για την εσωτερική γενετική ποικιλομορφία των κλώνων στον καρκίνο έχει αποδώσει το χρωμόσωμα από τον καρυότυπο, από τη γενετική ανάλυση της πολλαπλής εστίασης του καρκίνου, με βάση τη μέθοδο FISH από τμήματα του ιστού ή ανοσο-επιλεγμένα κύτταρα, από το μοριακό έλεγχο πολλαπλών μικρών βιοψιών ή από μικρή ανάλυση ιστού. Ο βαθμός της ποικιλομορφίας των κλώνων αποτελεί την προγνωστική της εξέλιξης της νόσου. Η γενετική ποικιλομορφία των πολλαπλασιαστικών κυττάρων του καρκίνου μπορεί να αποτελέσει ένα σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική θεραπεία.

Βιβλιογραφία!! ‘’ Genetic variegation of clonal architecture and propagating cells in leukaemia.’’ Nature 469, (2011)

Ευχαριστώ για την προσοχή σας!!