Προκαρυωτική Μεταγραφή ΙΙ: Το οπερόνιο της λακτόζης

Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης: Μεταγραφή Επεξεργασία μεταγράφου Μετάφραση Jacob και Monod (1961): trans-δραστικά προϊόντα cis-δραστικές αλληλουχίες

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.1 Ένα ρυθμιστικό γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που δρα σε μια θέση-στόχο πάνω στο DNA. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Η ρύθμιση μπορεί να είναι είτε αρνητική είτε θετική

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.2 Στον αρνητικό έλεγχο, ένας trans-δραστικός καταστολέας προσδένεται στο cis-δραστικό χειριστή και σταματά τη μεταγραφή. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.3 Στο θετικό έλεγχο, οι trans-δραστικοί παράγοντες πρέπει να προσδεθούν στις cis-δραστικές θέσεις προκειμένου η RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή από τον υποκινητή. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Τα δομικά γονίδια οργανώνονται σε συστοιχίες και ελέγχονται με συντονισμένο τρόπο

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.4 Το οπερόνιο lac καταλαμβάνει ~6.000 bp DNA. Το γονίδιο lacI (αριστερά) έχει το δικό του υποκινητή (P) και τερματιστή. Το άκρο του lacI βρίσκεται ακριβώς πριν τον υποκινητή των δομικών γονιδίων. Ο χειριστής (O) καταλαμβάνει τα πρώτα 26 bp της μεταγραφικής μονάδας. Το γονίδιο lacZ ξεκινά από τη βάση +39. Μετά από αυτό ακολουθούν τα γονίδια lacΥ και lacA. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Ο μεταβολισμός της λακτόζης

Τα γονίδια lac ελέγχονται από έναν καταστολέα Διακρίνουμε τα δομικά από τα ρυθμιστικά γονίδια μελετώντας τις μεταλλάξεις: Συνέπεια μετάλλαξης σε δομικό Συνέπεια μετάλλαξης σε ρυθμιστικό Το lacI εντοπίζεται δίπλα στα δομικά γονίδια του οπερονίου, μπορεί όμως να λειτουργήσει εξίσου καλά και αν μεταφερθεί σε άλλη θέση (κλασική δοκιμή για έναν trans-δραστικό ρυθμιστή)

Το οπερόνιο lac είναι επαγώγιμο Η σύνθεση ενζύμων ως απόκριση στην παρουσία ενός συγκεκριμένου υποστρώματος ονομάζεται επαγωγή. Απουσία β-γαλακτοζίτη υπάρχουν ~5 μόρια β-γαλακτοσιδάσης. Μέσα σε 2-3 λεπτά από την εμφάνιση β-γαλακτοζίτη εμφανίζονται ~5000 μόρια ενζύμου.

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.6 Η προσθήκη επαγωγέα προκαλεί τη γρήγορη επαγωγή του mRNA του οπερονίου lac και ακολουθείται από τη σύνθεση των ενζύμων, μετά από μια σύντομη φάση υστέρησης. Η απομάκρυνση του επαγωγέα ακολουθείται από γρήγορη παύση της σύνθεσης. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Ο καταστολέας ρυθμίζεται από ένα μικρομοριακό επαγωγέα Οι μη μεταβολίσιμοι επαγωγείς είναι πολύ χρήσιμοι για τη μελέτη της επαγωγής. Ο ισοπροπυλο-θειο-γαλακτοζίτης (IPTG) μοιάζει με τη λακτόζη αλλά δεν μεταβολίζεται από τη β-γαλακτοσιδάση.

Η δομή του IPTG

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.7 Ο καταστολέας διατηρεί το οπερόνιο lac στην ανενεργή κατάσταση μέσω της πρόσδεσής του στο χειριστή. Ο καταστολέας απεικονίζεται ως μια σειρά από συνδεδεμένες επικράτειες, όπως προέκυψαν από την ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.8 Η προσθήκη του επαγωγέα μετατρέπει τον καταστολέα στην ανενεργή μορφή του, που δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Τα κρίσιμα χαρακτηριστικά του κυκλώματος βασίζονται στις διττές ιδιότητες του καταστολέα: Εμποδίζει τη μεταγραφή Αναγνωρίζει τον επαγωγέα Αλλοστερικός έλεγχος: η ικανότητα μιας περιοχής της πρωτεΐνης να ελέγχει τη λειτουργία μιας άλλης.

Αρνητικός έλεγχος του lac οπερονίου

Οι μεταλλάξεις ενός χειριστή είναι cis-δραστικές Ο χειριστής αρχικά αναγνωρίστηκε από ιδιοστατικές μεταλλάξεις (OC).

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.9 Οι μεταλλάξεις του χειριστή είναι ιδιοστατικές, επειδή ο χειριστής καθίσταται ανίκανος να προσδέσει την πρωτεΐνη-καταστολέα. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να έχει απεριόριστη πρόσβαση στον υποκινητή. Οι μεταλλάξεις Oc είναι cis-δραστικές, επειδή επηρεάζουν μόνο τα συνεχόμενα συνδεδεμένα δομικά γονίδια.

Οι μεταλλάξεις ενός ρυθμιστικού γονιδίου είναι trans-δραστικές Ιδιοστατική μεταγραφή μπορεί να προκληθεί και από μεταλλάξεις τύπου lacI -

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.10 Οι μεταλλάξεις που απενεργοποιούν το γονίδιο lacI προκαλούν την ιδιοστατική έκφραση του οπερονίου, επειδή η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη του καταστολέα δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή.

Synthesis of β-galactosidase and permease in haploid and heterozygous diploid operator mutants

Synthesis of β-galactosidase and permease in haploid and heterozygous diploid operator mutants

O+ / OC heterozygotes demonstrate that operators are cis-acting

Synthesis of β-galactosidase and permease in haploid and heterozygous diploid strains carrying I+ and I- All strains are O+

Synthesis of β-galactosidase and permease in haploid and heterozygous diploid strains carrying I+ and I-

The recessive nature of I- mutations demonstrates that the repressor is trans-acting

Synthesis of β-galactosidase and permease by the wild type and by strains carrying different alleles of the I gene

The dominance of IS mutations is due to the inactivation of the allosteric site on the Lac repressor

Ο καταστολέας προσδένεται στο χειριστή

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.12 Ο χειριστής lac έχει συμμετρική αλληλουχία. Η αλληλουχία αριθμείται σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής στο +1. Τα ροζ βέλη αριστερά και δεξιά δείχνουν τις δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις. Με πράσινο φόντο εμφανίζονται οι ταυτόσημες θέσεις των δύο ανεστραμμένων επαναλήψεων. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.13 Οι βάσεις που έρχονται σε επαφή με τον καταστολέα μπορεί να ταυτοποιηθούν με ομοιοπολική διασύνδεση ή με πειράματα που δείχνουν αν η χημική μετατροπή τους αποτρέπει την πρόσδεση. Έτσι, αναγνωρίστηκαν θέσεις και στις δύο αλυσίδες του DNA, που εκτείνονται από το +1 έως το +23. Ιδιοστατικές μεταλλάξεις συμβαίνουν σε 8 θέσεις του χειριστή, ανάμεσα στο +5 και στο +17. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

O μονομερής καταστολέας φέρει αρκετές επικράτειες

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.15 Η δομή ενός μονομερούς του καταστολέα Lac αποκαλύπτει αρκετές ανεξάρτητες επικράτειες. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Mitchell Lewis. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Ο καταστολέας είναι ένα τετραμερές που αποτελείται από δύο διμερή

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.16 Η κρυσταλλική δομή του πυρήνα του καταστολέα Lac δείχνει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μονομερών μέσα στο τετραμερές. Οι φωτογραφίες είναι ευγενική προσφορά του Alan Friedman. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.17 Το τετραμερές του καταστολέα αποτελείται από δύο διμερή. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Η πρόσδεση στο DNA ρυθμίζεται από μια αλλοστερική αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης

Εικόνα 10.18 Ο επαγωγέας αλλάζει τη δομή του πυρήνα, έτσι ώστε οι κεφαλές του διμερούς καταστολέα να μην έχουν πια τον προσανατολισμό που επιτρέπει την πρόσδεσή τους στο DNA. Η πρόσδεση δύο μόνο μορίων επαγωγέα στο τετραμερές του καταστολέα επαρκεί για την άρση της καταστολής.

Οι φαινότυποι των μεταλλαγμάτων συσχετίζονται με τη δομική οργάνωση των επικρατειών Οι μεταλλάξεις του καταστολέα Lac προσδιόρισαν την ύπαρξη διαφορετικών επικρατειών πριν γίνει γνωστή η δομή του.

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.19 Οι θέσεις τριών τύπων μεταλλάξεων του καταστολέα Lac χαρτογραφούνται στη δομή των επικρατειών της πρωτεΐνης. Οι υποτελείς μεταλλάξεις lacI-, που αδυνατούν να καταστείλουν τη μεταγραφή, μπορεί να εντοπίζονται οπουδήποτε στην πρωτεΐνη. Οι επικρατείς αρνητικές μεταλλάξεις lacI-d, που επίσης αδυνατούν να καταστείλουν τη μεταγραφή, εντοπίζονται στην επικράτεια πρόσδεσης DNA. Οι επικρατείς μεταλλάξεις lacIS, που δεν μπορούν να επάγουν τη μεταγραφή επειδή δεν μπορούν να δεσμεύσουν τον επαγωγέα, εντοπίζονται στην κεντρική επικράτεια 1. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Ο καταστολέας προσδένεται σε τρεις χειριστές και αλληλεπιδρά με την RNA pol

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.20 Αν και τα δύο διμερή σε ένα τετραμερές καταστολέα προσδεθούν στο DNA, τότε το DNA ανάμεσα στις δύο θέσεις πρόσδεσης σχηματίζει ένα βρόχο. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Η δομή του τετραμερούς του καταστολέα προσδεμένου σε δύο χειριστές

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.21 Όταν ένας τετραμερής καταστολέας προσδένεται σε δύο χειριστές, η έκταση του DNA ανάμεσά τους εξωθείται στη δημιουργία ενός σφιχτού βρόχου. Η μπλε δομή στο κέντρο του βρόχου του DNA αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη CAP, άλλη μια ρυθμιστική πρωτεΐνη που προσδένεται στην περιοχή. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Mitchell Lewis. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Υπάρχουν δύο επιπλέον αλληλουχίες χειριστή στην περιοχή του οπερονίου lac. Ο πρωτότυπος χειριστής, O1, βρίσκεται ακριβώς στην αρχή του γονιδίου lacZ και έχει την ισχυρότερη συγγένεια για τον καταστολέα. Ο O2 βρίσκεται 410bp καθοδικά από το σημείο έναρξης και ο O3 βρίσκεται 83bp ανοδικά από αυτό. Εξάλειψη είτε του O2 ή του O3 μειώνει την αποτελεσματικότητα της καταστολής κατά 2-4 φορές. Αν και οι δύο εξαλειφθούν, η καταστολή μειώνεται κατά 100 φορές. Δεν είναι γνωστό γιατί. Γνωρίζουμε αρκετές λεπτομέρειες για τις άμεσες συνέπειες της πρόσδεσης του καταστολέα στον O1. Αρχικά υπήρχε η άποψη ότι η πρόσδεση του καταστολέα παρεμποδίζει την πρόσδεση της RNA pol στον υποκινητή. Τώρα είναι γνωστό ότι οι δύο πρωτεΐνες μπορεί να είναι προσδεδεμένες στο DNA ταυτόχρονα και ότι η πρόσδεση του καταστολέα ουσιαστικά ενισχύει την πρόσδεση της RNA pol! Όμως, το προσδεδεμένο ένζυμο εμποδίζει την έναρξη της μεταγραφής.

Θετικός vs αρνητικός έλεγχος

Εικόνα 11.3 Tα ρυθμιστικά κυκλώματα είναι ευέλικτα και, ανάλογα με το σχεδιασμό, ελέγχουν θετικά ή αρνητικά την επαγωγή ή την καταστολή.

Η καταστολή μέσω γλυκόζης ελέγχει τη χρήση των πηγών άνθρακα Η E. coli προτιμά τη γλυκόζη ως πηγή άνθρακα (glucose repression): η γλυκόζη παρεμποδίζει τη χρήση εναλλακτικών πηγών άνθρακα (=> καταστέλλει lac, gal, ara)

Εικόνα 11. 4 H γλυκόζη εισάγεται στο κύτταρο μέσω του συστήματος PTS Εικόνα 11.4 H γλυκόζη εισάγεται στο κύτταρο μέσω του συστήματος PTS. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απενεργοποίηση της περμεάσης της λακτόζης. Λόγω της απουσίας λακτόζης, ο καταστολέας lac καταστέλλει το οπερόνιο lac. Όταν απουσιάζει η γλυκόζη, η λακτόζη μπορεί να εισέλθει στο κύτταρο, όπου αδρανοποιεί τον καταστολέα και έτσι ενεργοποιείται το οπερόνιο lac. Pts: phosphotransferase system: μεμβρανικό σύμπλοκο που φωσφορυλιώνει σάκχαρα ενώ τα μεταφέρει στο κύτταρο. Στη μεταφορά της γλυκόζης, μια από τις πρωτεΐνες του PTS απο-φωσφορυλιώνεται και στη συνέχεια προσδένεται στην περμεάση Lac και την εμποδίζει να μεταφέρει λακτόζη.

To cAMP είναι ένας επαγωγέας που ενεργοποιεί την πρωτεΐνη CRP (CAP) Στη θετική ρύθμιση η RNA pol έχει ανάγκη από κάποιον θετικό ενεργοποιητή. Ο πιο διαδεδομένος είναι ο CRP. Ο CRP είναι ενεργός μόνο παρουσία cAMP. CRP: cAMP Receptor Protein CAP: Catabolite Activator Protein

Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 11.5 Tο cAMP περιέχει μία μόνο φωσφορική ομάδα που συνδέεται τόσο με το 5΄ όσο και με το 3΄ του δακτυλίου του σακχάρου. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Η νουκλεοτιδική αλληλουχία και τα γενετικά όρια της περιοχής ελέγχου οπερονίου της λακτόζης

Καταβολικός έλεγχος του οπερονίου lac

Αρνητικός και θετικός έλεγχος του οπερονίου lac από τον καταστολέα και την πρωτεΐνη CAP, αντίστοιχα

Τι να διαβάσετε Από Κεφάλαιο 10: Από Κεφάλαιο 11: 10.1 – 10.8 10.10 10.12 – 10.16 Από Κεφάλαιο 11: 11.2-11.4