ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Μαρια Σατρα Ε.ΔΙ.Π Εργ. Βιολογίας, Π.Θ.

To ανασυνδυασμένο DNA είναι ένα μόριο DNA το οποίο περιέχει γονίδια από δύο ή και περισσότερους διαφορετικούς οργανισμούς. Ο συνδυασμός των διαφορετικών μορίων συνήθως πραγματοποιείται μέσα σε ένα πλασμίδιο ή σε έναν ιό. Η μέθοδος του ανασυνδυασμένου DNA αναπτύχθηκε κατά τη δεκαετία του 1970 και σήμερα αποτελεί τη βάση της γενετικής μηχανικής

Tεχνικές του ανασυνδυασµένου DNA είναι ιδιαίτερα ισχυρές, καθώς µας παρέχουν τα εργαλεία για τη γενετική µελέτη οποιουδήποτε οργανισµού και για την αποµόνωση του DNA οποιουδήποτε σχεδόν γονιδίου. Μπορούµε να αποµονώσουµε ένα συγκεκριµένο γονίδιο, να το κλωνοποιήσουµε, προκειµένου να παραγάγουµε πολλαπλά αντίγραφά του, και να το αλληλουχίσουµε, προκειµένου να «διαβάσουµε» τη γενετική πληροφορία που περιέχει. να αναλύσουµε τη λειτουργία του γονιδίου αυτού µε µεταλλαξιγένεση in vitro, κατά την οποία προκαλούµε ειδικές τροποποιήσεις (µεταλλαγές) στην πληροφορία του και ακολούθως το επανεισαγάγουµε στον οργανισµό, για να προσδιορίσουµε τις συνέπειες αυτών των µεταλλαγών.

Ένζυμα για Πειραματισμό με το DNA Οι DNA πολυμεράσες είναι γνωστές για το ρόλο τους στην αντιγραφή του DNA, κατά την οποία χρησιμοποιούν μια αρχική αλυσίδα DNA ως "καλούπι - εκμαγείο" για τη σύνθεση μιας νέας, συμπληρωματικής με την μητρική. Mια αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίου (~20 νουκλεοτιδίων) η οποία οδηγεί τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλληλουχίας DNA. Εκκινητης- Mια αλληλουχία DNA ή RNA η οποία οδηγεί τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλληλουχίας. Εκμαγείο -

Η DNA πολυμεράση δημιουργεί ένα νέο πολυνουκλεοτίδιο DNA, του οποίου η αλληλουχία υπαγορεύεται μέσω του κανόνα της συμπληρωματικότητας των βάσεων, από την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του DNA / RNA που αντιγράφεται. 3΄----TACCCAACGCAATTC----5΄ 5΄----ATGG → Νέο DNA 5΄----ATGGGTTGCGTTAAG---3΄ To νέο νουκλεοτίδιο συντίθεται με κατεύθυνση 5΄→ 3΄

Μηχανισμός της DNA πολυμεράσης: Η σύνθεση του DNA προύποθέτει έναν εκκινητή 5΄ Εκκινητής 3΄ 5΄ 3΄ 3΄ 5΄ DNA πολυμεράση DNA πολυμεράση Εκκινητής Καμία σύνθεση Σύνθεση DNA Οι DNA πολυμεράσες προσθέτουν νουκλεοτίδια στο 3΄-άκρο μιας πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας. Για να αρχίσει η αντίδραση αυτή, οι DNA πολυμεράσες χρειάζονται έναν εκκινητή με μια ελεύθερη 3΄-υδροξυλική ομάδα που είναι ήδη συνδεδεμένη στο εκμαγείο με ζεύγη βάσεων. Δεν μπορούν να αρχίσουν από την αρχή προσθέτοντας νουκλεοτίδια σε ένα ελεύθερο μονόκλωνο εκμαγείο DNA.

O εκκινητής καθορίζει το τμήμα ενός μορίου DNA που θα αντιγραφεί Εκκινητής 5΄ 3΄ O εκκινητής καθορίζει το τμήμα ενός μορίου DNA που θα αντιγραφεί Δύο μεταλλικά ιόντα (συνήθως Mg2+) συμμετέχουν στην αντίδραση της DNA πολυμεράσης. Ένα μεταλλικό ιόν συντονίζει την 3’-υδροξυλική ομάδα του εκκινητή, ενώ η φωσφορική ομάδα του τριφωσφορικού δεοξυ-ριβονουκλεοζίτη λειτουργεί ως γέφυρα μεταξύ των δύο μεταλλικών ιόντων. Η υδροξυλική ομάδα του εκκινητή προσβάλλει τη φωσφορική ομάδα σχηματίζοντας έναν νέο δεσμό Ο–Ρ. Σημείωση -

Η DNA πολυμεράση διαθέτει πολλές λειτουργίες: 3΄- 5΄ενεργότητα εξωνουκλεάσης – επιτρέπει στο ένζυμο να αφαιρεί νουκλεοτίδια από το 3΄άκρο του νεοσυντιθέμενοιυ κλώνου, ώστε να διορθώνει λάθη απομακρύνοντας ένα νουκλεοτίδιο που έχει εισαχθεί λανθασμένα. 5΄- 3΄ενεργότητα εξωνουκλεάσης – Απομακρύνουν ένα τμήμα του πολυνουκλεοτιδίου που έχει ήδη προσδεθεί στον κλώνο – εκμαγείο τον οποίο αντιγράφει η πολυμεράση. Εκτοπισμένα νουκλεοτίδια Δημιουργεί προβλήματα σε πειράματα με μόρια DNA καθώς αφαιρεί νουκλεοτίδια από το 5΄άκρο των νεοσυντιθέμενων μορίων.

Η DNA πολυμεράση στην Έρευνα Aρκετές από τις DNA πολυμεράσες είναι εκδοχές του ενζύμου DNA πολυμεράση Ι του E.coli. Πολυμεράση Περιγραφή Κύρια Χρήση DNA πολυμεράση Ι Μη τροποποιημένο ένζυμο του E.coli Σήμανση DNA Πολυμεράση Klenow Τροποποιημένη εκδοχή της DNA πολυμεράσης Ι του E.coli Σεκουενάση Τροποποιημένη εκδοχή της DNA πολυμεράσης Ι του φάγου Τ7 Αλληλούχιση του DNA Taq πολυμεράση DNA πολυμεράση Ι του Thermus aquaticus PCR Αντίστροφη μεταγραφάση DNA πολυμεράση που εξαρτάται από RNA, λαμβάνεται από διάφορους ρετροϊούς. Σύνθεση cDNA

Αντίστροφη μεταγραφάση Ένζυμο που κωδικοποιείται από ρετροϊούς, όπως ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), το οποίο συνθέτει ένα αντίγραφο DNA του ιικού γονιδιώματος από την RNA μήτρα του ιού. Η απομονώμένη αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα στη μοριακή βιολογία για την κλωνοποίηση συμπληρωματικού DNA (που κωδικοποιεί το γονίδιο που μας ενδιαφέρει) από το mRNA. 

 Νουκλεάσες   Ένζύμα τα οποία καταλύουν την υδρόλυση των νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA) προς μεμονωμένα νουκλεοτίδια. Συγκεκριμένα, η δράση τους περιλαμβάνει τη διάσπαση των φωσφοδιεστερικών δεσμών με τους οποίους είναι συνδεδεμένα τα νουκλεοτίδια. Διακρίνονται σε : εξωνουκλεάσες - απομακρύνουν νουκλεοτίδια από τα άκρα του DNA / RNA. ενδονουκλεάσες – διασπούν εσωτερικούς φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

μια δίκλωνη εντομή σε αυτή την αλληλουχία. Περιοριστική Ενδονουκλεάση Ένζυμο που προσδένεται σε μια ειδική αλληλουχία ενός μορίου DNA και προκαλεί μια δίκλωνη εντομή σε αυτή την αλληλουχία. Οι περισσότερες από αυτές αναγνωρίζουν αλληλουχίες μήκους 4 ως 8 ζευγών βάσεων που παρουσιάζουν σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις ένα είδος συμμετρίας (η μισή αλληλουχία στον ένα κλώνο έχει σχέση αντικειμένου-ειδώλου με τη μισή αλληλουχία στον άλλο κλώνο) και αποτελούν παλίνδρομα, δηλαδή διαβάζονται με τον ίδιο τρόπο και προς τις δύο κατευθύνσεις. Τα σημεία κοπής του DNA σε κάθε κλώνο είναι επίσης συμμετρικά μεταξύ τους. Η πιο διαδεδομένη περιοριστική ενδονουκλεάση είναι η EcoRI που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli.

Εντομές που παράγονται από τη δράση της Sma I. Δημιουργεί μια απλή δίκλωνη εντομή, αποδίδοντας αμβλύ άκρο (blunt end). Εντομές που παράγονται από τη δράση της EcoRI. Κόβουν τους δύο κλώνους του DNA σε διαφορετικές θέσεις και προκύπτουν κομμάτια με βραχείες, μονόκλωνες προεκτάσεις σε κάθε άκρο (sticky, cohesive ends).

Μετά την κατεργασία με περιοριστική ενδονουκλεάση, τα κλάσματα DNA που προκύπτουν εξετάζονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, ώστε να καθοριστεί το μέγεθός τους. Αν το DNA δεν έχει «σπάσει»: κάθε κλάσμα μπορεί να γίνει ορατό ως ξεχωριστή ζώνη (band) πάνω στην πηκτή. Αν το DNA έχει «σπάσει»: θα φανεί ένα «λευκό λέκιασμα» (Smear).

Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης smear band

Προϊόντα πέψης (θέσεις 7,8 και 9) του παραπάνω PCR με το ένζυμο Rsa I. Η μεταλλαγή IVSII-745 (CG) του β-γονιδίου σφαιρίνης συνίσταται σε αλλαγή της φυσιολογικής βάσης C που υπάρχει στο νουκλεοτίδιο 745 του δεύτερου εξωνίου, σε G. Η μεταλλαγή αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία φαινοτύπου β-θαλασσαιμίας. Η αλλαγή στην αλληλουχία από CTAC σε GTAC δημιουργεί αλληλουχία αναγνώρισης για την περιοριστική ενδονουκλεάση Rsa I. Ύπαρξη της μεταλλαγής IVSII-745 οδηγεί σε πέψη του προϊόντος PCR, μετά από την επώασή του με το ένζυμο Rsa I, σε δύο τμήματα DNA μήκους 350 και 200 νουκλεοτιδίων αντίστοιχα. Το αποτέλεσμα της επώασης στις θέσεις 7 και 9 μας οδηγεί στο συπέρασμα ότι τα αντίστοιχα άτομα είναι ομόζυγα για την παραπάνω μεταλλαγή, ενώ το άτομο που αντιστοιχεί στη θέση 8 είναι ετερόζυγο.

Southern hybridization να απομονωθεί το DNA. Τα κλάσματα περιορισμού από την πηκτή μεταφέρονται σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης /nylon. Επίστρωση της μεμβράνης στην πηκτή & διαπότισή της με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, το οποίο μεταφέρει το DNA. Aκινητοποίηση των ζωνών DNA στις ίδιες θέσεις πάνω στην μεμβράνη. Ανιχνευτής Υβριδισμού (Probe) Σημασμένο μόριο DNA με αλληλουχία συμπληρωματική προς το DNA στόχο το οποίο επιθυμούμε να ανιχνεύσουμε. (Υβριδοποίηση) Η θέση του υβριδοποιημένου ανιχνευτή ταυτοποιείται με ανίχνευση του σήματος που είναι προσδεδεμένο πάνω του. Το σήμα ανιχνεύεται με αυτοραδιογραφία.

DNA Λιγκάση (DNA δεσμάση) περιοριστική ενδονουκλεάση Αν τα δύο μόρια έχουν συμπληρωματικά κολλώδη άκρα, σχηματίζονται παροδικά ζεύγη βάσεων (δεσμοί υδρογόνου) μεταξύ τους. Η ισχυροποίηση της ένωσης γίνεται με τη DNA λιγκάση η οποία δημιουργεί φωσφοδιεστερικόύς δεσμούς. Αν τα δύο μόρια έχουν αμβλέα άκρα, δεν σχηματίζονται ζεύγη βάσεων ούτε καν παροδικά – λιγότερο αποτελεσματική σύνδεση

Κλωνοποίηση DNA ∆ύο άσχετα µεταξύ τους μόρια DNA, προϊόντα πέψης δύο διαφορετικών δειγµάτων µέ το ίδιο περιοριστικό ένζυµο, µπορούν να συνδεθούν προσωρινά βάσει της ικανότητας των κολλώδων τους άκρων να υβριδοποιούνται. H σύνδεση αυτή είναι προσωρινή γιατί στηρίζεται σε δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των αζωτούχων βάσεων, αλλά µπορεί να µονιµοποιηθεί µε το κλείσιµο των εγκοπών, δηλ. τον σχηµατισµό φωσφοδιεστερικών (οµοιοπολικών) δεσµών. Aυτό επιτυγχάνεται µε το ένζυµο DNA λιγκάση. Φορέας κλωνοποίησης -   είναι ένα γενετικό στοιχείο, συνήθως ένας βακτηριοφάγος ή ένα πλασμίδιο, το οποίο χρησιμοποιείται για να δέχεται και να μεταφέρει ένα κομμάτι DNA (ένθεση) σε ένα κύτταρο αποδέκτη (ξενιστής), με σκοπό την κλωνοποίησή του.

Μερικές συνηθισμένες κατηγορίες φορέων θα αναφερθούν σε συντομία παρακάτω.   1. Πλασμίδια: Εχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται σε πολλά (μέχρι 50) αντίγραφα ανά κύτταρο. Περιέχουν ένα τουλάχιστο γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό (αμπικιλλίνη, τετρακυκλίνη, καναμυκίνη και χλωραμφενικόλη είναι τα πιό κοινά αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται για το σκοπό αυτό), πράγμα που είναι απαραίτητο για τη φαινοτυπική διαφοροποίηση των μετασχηματισμένων βακτηρίων-ξενιστών. Σε αυτή την  κατηγορία ανήκουν και πλασμίδια που έχουν και άλλες, πέρα από την ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά, γενετικές ιδιότητες όπως είναι η δυνατότητα να μεταβολίζουν γαλακτόζη (γονίδιο lacZ της β-γαλακτοζιδάσης), τα οποία αναγνωρίζονται εύκολα σε τρυβλία  που περιέχουν κατάλληλα υποστρώματα (Χ-gal).

Γονίδιο ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικό (αμπικιλλίνη) – επιλογή βακτηρίων που έχουν προσλάβει το πλασμίδιο από εκείνα που δεν το έχουν προσλάβει. Θέση έναρξης της αντιγραφής - αναγνωρiζεται από την DNA πολυμεράση LacZ γονίδιο – κωδικοποιεί ένζυμο β-γαλακτοζιδάση που διασπά τη λακτόζη σε γλυκόζη και γαλακτόζη.

Μερικές συνηθισμένες κατηγορίες φορέων θα αναφερθούν σε συντομία παρακάτω.   2. Φάγοι: Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενοι βακτηριοφάγοι φορείς είναι ο λ και ο Μ13. Και οι δυο πολλαπλασιάζουν το DNA τους σε υψηλά επίπεδα κατά τη μόλυνση του ξενιστή (βακτηρίου) και παράγουν ιοειδή, τα οποία ελευθερώνονται στο θρεπτικό μέσο, κάνοντας έτσι τη συλλογή τους για την παρασκευή DNA ιδιαίτερα εύκολη. Η παρουσία τους είναι από μόνη της εμφανής (ευκρινείς πλάκες που εντοπίζονται σε περιβάλλον βακτηριακής χλόης) και έτσι δεν χρειάζονται γενετικοί δείκτες, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των πλασμιδίων. Ο λ φάγος έχει γονιδίωμα περίπου 50 kb. Οι 20 kb είναι περιττές για την αύξησή του στην E.coli και μπορούν να αντικατασταθούν με ξένο DNA. Η ικανότητά του να δέχεται μεγάλα ενθέματα τον κάνει ιδανικό για την κατασκευή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών.

Μερικές συνηθισμένες κατηγορίες φορέων θα αναφερθούν σε συντομία παρακάτω.   3. Κοσμίδια: Eίναι φορείς - υβρίδια μεταξύ λ φάγου και πλασμιδίου, οι οποίοι αντιπαρέρχονται την αδυναμία των προηγούμενων φορέων να μεταφέρουν μεγάλα κομμάτια DNA (τα κοσμίδια μπορούν να μεταφέρουν μέχρι και 45 kb). Το DNA τους μπορεί να αντιγράφεται όπως ένα πλασμίδιο και να πακετάρεται όπως συμβαίνει σε  ένα φάγο. Η δημιουργία τους βασίζεται στην παρουσία των αλληλουχιών cos του φάγου (cos sites), οι οποίες είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των γονιδίων που δημιουργούν την πρωτεϊνική κάψα του φάγου. Αν ανάμεσα στις δυο περιοχές cos κλωνοποιηθεί μια πλασμιδιακή περιοχή που περιέχει ένα γονίδιο-δείκτη ανθεκτικότητας σε ένα αντιβιοτικό και ένα πολυσυνδέτη (polylinker ή Multiple Cloning Site-MCS) για να εισαχθεί το ξένο DNA, τότε δημιουργείται ένακοσμίδιο  Το γεγονός ότι τα κοσμίδια έχουν τη δυνατότητα ενσωμάτωσης μεγάλων μορίων DNA, αποτελεί και το κυριότερο πλεονέκτημά τους για την κατασκευή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών.

Κλωνοποίηση DNA Μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια που δεν έχουν προσλάβει το επιθυμητό γονίδιο Μετασχηματισμός Το ανασυνδυασμένο DNA εισάγεται σε βακτηριακό κύτταρο, του οποίου τα τοιχώματα γίνονται παροδικά διαπερατά έπειτα από επεξεργασία με χημικές ουσίες. Ανασυνδυασμένα πλασμίδια Διάκριση βακτηριακών κλώνων που έχουν προσλάβει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο από εκείνα που έχουν το μη ανασυνδυασμένο. Στο άγαρ μαζί με το αντιβιοτικό προσθήκη X-gal. Μπλε αποικίες–μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Λευκές αποικίες- ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Επιτρέπει, εκατομμύρια φορές, την επιλεκτική αντιγραφή ειδικών αλληλουχιών DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου Εφαρμόζεται από το 1985 Συμβάλλει στην Ιατρική (διάγνωση ασθενειών π.χ. AIDS) Εγκληματολογία (διαλεύκανση υποθέσεων) Μελέτη απολιθωμάτων

Μέθοδοι ανίχνευσης της Real Time PCR Μέθοδος πρόσδεσης φθορίζουσας ουσίας (SYBR Green I) Χρωστική που προσδένεται στο DNA διπλής έλικας Ανιχνεύει ειδικά και μη ειδικά προϊόντα καθώς και διμερή των εκκινητών Μέθοδος ανιχνευτών (probe chemistry) Hybridization Probes Hydrolysis Probes Αναγνώριση ειδικών αλληλουχιών  ΥΨΗΛΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ

Μέθοδος πρόσδεσης φθορίζουσας ουσίας Γενικές εμβόλιμες χρωστικές στη διπλή έλικα του DNA SYBR Green I, Eva Green, LC Green κτλ. Απλές και οικονομικές Ανιχνεύει προϊόντα DNA διπλής έλικας Μη-ειδικός πολλαπλασιασμός δυσκολεύει την ανίχνευση των προϊόντων χαμηλής συγκέντρωσης οι συνθήκες της PCR πρέπει να είναι αυστηρές (primers, MgCl2) Καμπύλη τήξης του DNA (melting curve) ή ηλεκτροφόρηση προς επιβεβαίωση

Μέθοδος πρόσδεσης φθορίζουσας ουσίας SYBR Green I SYBR Gr

Μέθοδος πρόσδεσης φθορίζουσας ουσίας Ποσοτικοποίηση Καμπύλη τήξης

Κινητική της Real Time PCR Φάση plateau η αντίδραση σταματά καθώς τα αντιδραστήρια εξαντλούνται Τελικό σημείο (δεν ποσοτικοποιείται) Διάγραμμα πολλαπλασιασμού της Real Time PCR Η αύξηση του σήματος οφείλεται στην αύξηση του αριθμού των μορίων DNA κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Λογαριθμική Φάση το σήμα «διπλασιάζεται» σε κάθε κύκλο Στόχος υψηλής συγκέντρωσης (π.χ. ~108 copies) Στόχος χαμηλής συγκέντρωσης (π.χ. ~103 copies) (φθορισμός) Σήμα  Αχική lag φάση Δεν ανιχνεύεται σήμα Κατώτατο όριο ανίχνευσης Χαμηλό Cτ = υψηλή συγκέντρωση πολλαπλασιαζεται νωρίτερα Υψηλό CT = χαμηλή συγκέντρωση πολλαπλασιάζεται αργότερα CT = threshold cycle (ο κύκλος όπου το σήμα περνά το κατώτατο όριο ανίχνευσης) Χρόνος  (κύκλοι πολλαπλασιασμού)

Κινητική: Καμπύλη αναφοράς Καμπύλη αναφοράς με τρία πρότυπα συγκέντρωσης 106, 105 και 104 copies (αντίγραφα DNA) Όσο λιγότερη είναι η αρχική συγκέντρωση τόσο περισσότεροι κύκλοι χρειάζονται ώστε η αντίδραση να εισέρθει στη log φάση της

Κινητική: Καμπύλη αναφοράς Γονίδιο στόχος Cycles N Cp N (copy number) Cp Crossing Point (Cycles) log (copy number) Πρότυπα γνωστής συγκέντρωσης Άγνωστο δείγμα Άγνωστο δείγμα N = N0 x En Η καμπύλη αναφοράς σχηματίζεται από εξωτερικά πρότυπα γνωστής συγκέντρωσης. Τουλάχιστον τρία πρότυπα είναι απαραίτητα για τη δημιουργία της καμπύλης

N = N0 x En Ποσοτικοποίηση Η μέγιστη δυνατή αποδοτικότητα (efficiency) σε μία PCR είναι «2» δηλαδή κάθε προϊόν της PCR διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο.

Κινητική: Αποδοτικότητα της Real Time PCR Αρ Κύκλων Ποσότητα DNA 1 2 4 3 8 16 5 32 6 64 7 128 256 9 512 10 1024 Αρ Κύκλων Ποσότητα DNA 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 200000000 400000000 600000000 800000000 1000000000 1200000000 1400000000 1600000000 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1000000000 10000000000 5 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA

Κινητική: Αποδοτικότητα της Real Time PCR Αρ. Κύκλων 100% efficiency 90% efficiency 80% efficiency 70% efficiency 1 2 4 3 8 7 6 5 16 13 10 32 25 19 14 33,554,432 9,304,650 2,408,866 577,063 26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007 27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711 28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109 29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686 30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466 Μετά από 1 κύκλο 100% = 2,00x 90% = 1,90x 80% = 1,80x 70% = 1,70x

Πλεονεκτήματα της Real Time PCR Ποσοτικοποίηση Μειώνει τις εκατέρωθεν διαδικασίες – λιγότερος χρόνος και χρήμα Ελαχιστοποιεί τον απαιτούμενο αριθμό αντιγράφων για την παραγωγή αντιληπτού αποτελέσματος Δυνατότητα ανίχνευσης περισσότερο από ένα στόχους στο ίδιο σωληνάριο ταυτόχρονα (multiplexing) Δυνατότητα ανίχνευσης στόχων χαμηλής συγκέντρωσης από μικρής ποσότητας αρχικού υλικού (υψηλή ευαισθησία)

Εφαρμογές της Real Time PCR Γονιδιακή έκφραση Διάγνωση γενετικών ασθενειών Κληρομομήσιμα σύνδρομα: γονοτύπηση ασθενών μέσω της ανάλυσης των SNPs (σημειακές μεταλλάξεις) Προγεννετική διάγνωση: ανάλυση μεταλλάξεων Νεοπλασία: ανάλυση γονιδιακής έκφρασης Ανίχευση παθογόνων Ιοί, βακτήρια και μύκητες: πχ ιικό φορτίο Ταυτοποίηση του DNA (DNA fingerprinting) Οικογενείς σχέσεις Εγκληματολογική επιστήμη: ταυτοποίηση (STRs, AFLPs κτλ) Ανάκτηση του DNA (ancient DNA)