Βιολογικός ρόλος της Απολιποπρωτεΐνης J/Clusterin σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα. Άννα Γιοράν Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών & Βιοτεχνολογίας, Βασ. Κων/νου 48, 11635, Αθήνα

Εισαγωγή H ανθρώπινη Apolipoprotein J/Clusterin (CLU) είναι μια εκκρινόμενη ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη ~ 75-80 kDa η οποία εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς και βρίσκεται σε σχετικά μεγάλη συγκέντρωση σε όλα τα βιολογικά υγρά του ανθρώπου. Στο αίμα η CLU δρα κυρίως ως Απολιποπρωτεΐνη και εντοπίζεται στα HDL κυστίδια. Εμφανίζει επίσης δράση μοριακής συνοδού (molecular chaperon). Έχει προταθεί ότι η sCLU εμπλέκεται λειτουργικά σε μοριακές διαδικασίες: Ανάπτυξης Διαφοροποίησης Γήρανσης Αθηροσκλήρωσης Διαβήτη Νευροεκφυλιστικών νόσων Καρκινογένεσης

Εισαγωγή

Εισαγωγή ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ Ο καρκίνος του ήπατος είναι η έκτη συχνότερη κακοήθεια και η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτου λόγω καρκίνου, παγκοσμίως. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι η πιο συνήθης πρωτοπαθής κακοήθεια του ήπατος στους ενήλικες. Επιθηλιακά ηπατοκαρκινώματα Ηπατοβλάστωμα Ινοπεταλιώδες καρκίνωμα Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Διαυγοκυτταρικό Θυλακώδες Μικροί όγκοι Σκληρυντικό Συνδυασμένο ηπατικό/χολαγγειακό καρκίνωμα Μεταβατικός ηπατοκυτταρικός όγκος Μικτού τύπου καρκινώματα

Εισαγωγή ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΑΓΚΡΕΑΤΟΣ Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ο 13ος πιο συχνός τύπος καρκίνου σε παγκόσμιο επίπεδο. Αρκετά συχνά έχει κακή πρόγνωση, γεγονός που τον καθιστά την 8η πιο συχνή αιτία θανάτου λόγω καρκίνου. Παγκρεατικές νεοπλασίες Νεοπλασίες παγκρεατικού πόρου Νεοπλάσματα ενδοκρινικής μοίρας Καρκίνωμα κυττάρων λοβιδίων Παγκρεατοβλάστωμα Άλλοι τύποι

Σκοπός της μελέτης... ...είναι η διερεύνηση του λειτουργικού ρόλου της CLU σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα και η καταγραφή των επαγώμενων φαινοτύπων είτε λόγω γονιδιακής υπερέκφρασης (μέθοδος διαγονιδίου - transgene) είτε μέσω επίτευξης γονιδιακής σιγής (μέθοδος μικρών RNAs παρεμβολής - siRNA) για το γονίδιο της CLU. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στη λειτουργική σχέση της sCLU με το σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1.

Υλικά & Μέθοδοι Ανθρώπινες ηπατικές (HepG2 και Huh-7) και παγκρεατικές (Panc1) καρκινικές κυτταρικές σειρές. HepG2 Huh-7 Panc1 Γονιδιακή υπερέκφραση CLU specific siRNA oligonucleotide Περισσοτερο διαφοροποιημενη η HepG2 συγκριτικα με την Huh7. Τα Panc1 ειναι απο νεοπλασια παγκρεατικου πορου Γονιδιακή σιγή Ποσοτικό RT-PCR Ανοσοστύπωμα

Αποτελέσματα Σύγκριση των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της CLU μεταξύ των ηπατικών κυτταρικών σειρών. Huh7 HepG2 psCLU 86 kDa sCLU 47 kDa 34 kDa GAPDH 47 kDa Σύγκριση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυτταρικών σειρών Huh7 και ΗepG2. Τα HepG2 πολλαπλασιαζονται πιο γρηγορα-πιο μικρα-σχηματιζουν νησιδες

Αποτελέσματα Απομόνωση κλωνοποιημένου πλασμιδίου από μετασχηματισμένα βακτήρια. Πέψεις με περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με το ανθρώπινο γονίδιο της CLU. Mock-24h Mock-48h Vector-48h CLU-48h Vector-24h CLU-24h psCLU Huh7 sCLU GAPDH psCLU HepG2 sCLU GAPDH psCLU Panc1 GAPDH Αναμενόμενες ζώνες: BamHI: 1567 bp, 5.5 kb EcoRI: 705 bp, 872 bp, 5.5 kb

Αποτελέσματα Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων Huh7, HepG2 και Panc1.

Αποτελέσματα Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με sCLU-ειδικά siRNAs για τη μερική σίγηση της έκφρασης του γονιδίου CLU. Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης του γονιδίου της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων. Scramble siRNA Scramble siRNA Mock Mock 48h 72h CLU Huh7 GAPDH HepG2 CLU GAPDH Scramble siRNA Mock 72h CLU Panc1 GAPDH

Αποτελέσματα Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο σηματοδοτκό μονοπάτι INS/IGF-1. Έλεγχος με RT-PCR. Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western. Mock-24h Vector-24h CLU-24h Mock-48h Vector-48h CLU-48h Huh7 ERK-1 Vector-48h Mock-24h Vector-24h Mock-48h p-Akt CLU-24h CLU-48h HepG2 Akt ERK-1 GAPDH p-Akt mTOR Akt SOS1 GAPDH GAPDH Μειωση του SOS που συμμετέχει στο μονοπατι MAPK που επαγει αυξηση Αύξηση του mTOR επαγει πρωτεινοσυνθετικη μηχανη που μπορει να ειναι απαραιτητη για ενα κυτταρο που βρισκεται υπο στρες. Η αύξηση του mTOR πιθανόν να επαγεται απο το Akt που είναι επίσης αυξημενο mTOR Mock-24h Vector-24h CLU-24h Mock-48h Vector-48h CLU-48h SOS1 Panc1 GAPDH ERK-1 GAPDH p-ERK mTOR p-mTOR SOS1 GAPDH

Αποτελέσματα Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης της CLU στα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1. Έλεγχος με RT-PCR. Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western. Mock Scramble Scramble siRNA Mock siRNA Huh7 HepG2 Panc1 ERK-1 ERK-1 GAPDH GAPDH Akt Akt GAPDH GAPDH mTOR mTOR SOS1 SOS1 GAPDH GAPDH Mock Scramble siRNA Αύξηση του Akt που ειναι κομβικο μοριο για πολλες κυτταρικες λειτουργιες. H Panc1 δείχνει και αύξηση στη φωσφορυλιωμενη μορφη. Αυξηση του SOS που συμμετεχει στο MAPK συμβαδιζει με την αύξηση του proliferation Panc1 ERK-1 Akt GAPDH p-ERK p-Akt mTOR GAPDH p-mTOR GAPDH

Αποτελέσματα Υπερέκφραση sCLU Σίγηση sCLU Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western / ποσοτικοποίηση ζωνών. Υπερέκφραση sCLU Σίγηση sCLU HepG2 Huh7 Μειωση του SOS που συμμετέχει στο μονοπατι MAPK που επαγει αυξηση Αύξηση του mTOR επαγει πρωτεινοσυνθετικη μηχανη που μπορει να ειναι απαραιτητη για ενα κυτταρο που βρισκεται υπο στρες. Η αύξηση του mTOR πιθανόν να επαγεται απο το Akt που είναι επίσης αυξημενο Panc1 Panc1

Αποτελέσματα Έλεγχος επίδρασης του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου Doxorubicin (DXR) στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων και στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Τα HepG2 πολλαπλασιαζονται πιο γρηγορα-πιο μικρα-σχηματιζουν νησιδες 15

Συμπεράσματα Τα ενδογενώς υψηλά επίπεδα έκφρασης της CLU σε καρκινικά κύτταρα ενδεχομένως συμβάλλουν σε μείωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού και στην εμφάνιση χημειοανθεκτικότητας. Εξωγενώς επαγώμενη υπερέκφραση της CLU μειώνει το πολλαπλασιαστικό δυναμικό ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Μείωση των επιπέδων έκφρασης της CLU αυξάνει το ρυθμό αύξησης ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Ενδεχομένως οι αλλαγές στην έκφραση της CLU να επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου mTOR. Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα μας, τα επίπεδα έκφρασης της CLU δεν φαίνεται να επηρεάζουν άμεσα το μονοπάτι σηματοδότησης INS/IGF-1. Να επισημάνω ότι τα συμπεράσματα 2 και 3 είναι εξαρτώμενα από τον κυτταρικό τύπο φέρνοντας παραδείγματα από άλλες μελέτες.

Ευχαριστίες... ΕΚΠΑ, Τμήμα Βιολογίας: Ιωάννης Π. Τρουγκάκος (επιβλέπων) Λουκάς Χ. Μαργαρίτης Ιωάννης Γρίβας Ελένη Τσακίρη Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών: Ευστάθιος Σ. Γκόνος Νίκη Χονδρογιάννη Επιστημονικό προσωπικό του Προγράμματος Μοριακής και Κυτταρικής Γήρανσης