Μάθημα 8 Από την αλληλουχία του γονιδιώματος στη λειτουργία των γονιδίων

Ανάμεσα στις θεμελιώδεις μετρήσεις της μοριακής βιολογίας είναι: Προσδιορισμός παρουσίας / απουσίας Προσδιορισμός αριθμού αντιγράφων Προσδιορισμός σχετικής ποσότητας mRNA στο κύτταρο Ποιες συγκεκριμένες παραλλαγές ενός γονιδίου διαθέτει το υπό μελέτη άτομο;

ΕΙΚΟΝΑ 13.1: Μέτρηση των επιπέδων mRNA με στύπωμα κουκκίδας και υβριδοποίηση.

Μικροσυστοιχίες Ταυτόχρονη ανάλυση δεκάδων έως εκατοντάδων χιλιάδων κουκίδων ταυτόχρονα. Αυτοματοποιημένη μέθοδος καθήλωσης κουκίδων σε γυάλινο πλακίδιο. Δύο προσεγγίσεις: Ταυτόχρονη σύνθεση και καθήλωση ολιγονουκλεοτιδίων σε γυάλινο υπόστρωμα (DNA chip) Σύνθεση κλώνων DNA ή PCR προϊόντων και στη συνέχεια καθήλωση (microarrays – στικτές μικροσυστοιχίες)

Φωτολιθογραφική σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων

EIKONA 13.2: Δημιουργία μικροσυστοιχιών ολιγονουκλεοτιδίων πολύ υψηλής πυκνότητας μέσω φωτολιθογραφικής διαδικασίας.

Η διαδικασία της φωτολιθογραφίας υιοθετήθηκε στα τέλη δεκαετίας ’80 από τον Stephen Fodor Μικροσυστοιχίες πρωτο-παρήχθησαν από την Affymetrix Το chip μπορεί να φέρει πάνω από ένα εκατομμύρια θέσεις με σταθερή απόσταση μεταξύ τους

Ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες γονιδιακής έκφρασης της Affymetrics 22 διαφορετικά ολιγονουκλεοτίδια (25μερή) για κάθε γονίδιο που ελέγχεται. Τα 11 25μερή έχουν την ακριβή αλληλουχία διαφόρων τμημάτων του mRNA που μεταγράφεται από το γονίδιο Τα άλλα 11 έχουν αλληλουχία πανομοιότυπη με αυτή των προηγούμενων εκτός από μία λανθασμένη βάση στο κέντρο.

Για τον εντοπισμό κάθε μορίου στις μικροσυστοιχίες που κατασκευάζονται μέσω φωτολιθογραφίας χρησιμοποιούνται πολυάριθμα ολιγονουκλεοτίδια. Για κάθε τμήμα DNA επιλέγονται 11 τμήματά του Τα ολιγονουκλεοτίδια έχουν μικρό μήκος: ορισμένες φορές δίνουν ψευδώς θετικό ή αρνητικό σήμα Όταν η διαφορά υβριδοποίησης ανάμεσα στα πλήρως συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια και εκείνα με την αναντιστοιχία είναι μικρή, αφαιρούνται από την ανάλυση

ΕΙΚΟΝΑ 13.4: Υβριδοποίηση τμημάτων mRNA σε μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων.

NimbleGen Systems: φωτολιθογραφία με σύνθεση χωρίς μάσκα Agilent Technologies: σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων in situ, βασισμένη σε τεχνολογία τύπου ink jet. NimbleGen Systems: φωτολιθογραφία με σύνθεση χωρίς μάσκα Μικροσυστοιχίες εξαιρετικά υψηλής πυκνότητας Ολιγονουκλεοτίδια μεγαλύτερου μήκους (50-70 έως και 100 νουκλεοτίδια)

Στικτές μικροσυστοιχίες Πλασμιδιακοί cDNA κλώνοι (από EST projects) Ενίσχυση ενθέματος με PCR Αποδιάταξη PCR προϊόντων και καθήλωση σε γυάλινο πλακίδιο (με ρομποτική) Έως 20,000 κουκίδες ανά cm2 Μικρότερη πυκνότητα κουκίδων από φωτολιθογραφία αλλά μεγαλύτερα τμήματα DNA. Έτσι, μια κουκίδα ανά cDNA είναι αρκετή

Μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων (φωτολιθογραφία) ~1,000,000 κουκίδες Κάθε γονίδιο αντιπροσωπεύεται με 11 25-μερή, δηλαδή 275 bp Σύνολο πληροφορίας: 1,000,000 x 25 bp / 2 = 25,000,000 bp/ 2 = 12,500,000 bp. Στικτές μικροσυστοιχίες (cDNA) ~20,000 κουκίδες Κάθε κουκίδα και γονίδιο (EST: ~500 bp) Σύνολο πληροφορίας: 20,000 x 500 bp = 10,000,000 bp

ΕΙΚΟΝΑ 13.5: Τα πειράματα με στικτές μικροσυστοιχίες cDNA είναι περισσότερο ακριβή όταν χρησιμοποιείται ένα δείγμα αναφοράς («στρατηγική των δύο χρωστικών»).

Προσδιορισμός προτύπων έκφρασης mRNA Προ-γονιδιωματικής: προστασία από νουκλεάση στύπωμα Northern quantitative PCR Έλεγχος λίγων γονιδίων Γονιδιωματική: Ταυτόχρονος έλεγχος επιπέδου έκφρασης χιλιάδων γονιδίων Ιεραρχική ομαδοποίηση → «θερμικός χάρτης»

ΕΙΚΟΝΑ 13.6: Με τη χρήση μικροσυστοιχιών αποκαλύφθηκε ότι κατά την απόκριση ινοβλαστών σε αυξητικούς παράγοντες μεταβάλλεται το πρότυπο έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στην επούλωση των πληγών.

Όμως… Οι μικροσυστοιχίες βασίζονται στην υβριδοποίηση, μια διαδικασία που παρουσιάζει διακυμάνσεις από πείραμα σε πείραμα: Τα καθηλωμένα DNA (είτε oligos είτε cDNA) δεν είναι πάντα σε μεγάλη περίσσεια σε σχέση με την ποσότητα του mRNA του εξεταζόμενου δείγματος Συχνά συμβαίνει cross-hybridization λόγω ύπαρξης τμημάτων με παρεμφερείς αλληλουχίες

Η σχέση μεταξύ έντασης υβριδισμού και ποσότητας ανιχνευτή

Όμως… Οι μικροσυστοιχίες βασίζονται στην υβριδοποίηση, μια διαδικασία που παρουσιάζει διακυμάνσεις από πείραμα σε πείραμα: Τα καθηλωμένα DNA (είτε oligos είτε cDNA) δεν είναι πάντα σε μεγάλη περίσσεια σε σχέση με την ποσότητα του mRNA του εξεταζόμενου δείγματος Συχνά συμβαίνει cross-hybridization λόγω ύπαρξης τμημάτων με παρεμφερείς αλληλουχίες

Εναλλακτική συρραφή

Προσδιορισμός επιπέδων mRNA με υψηλής απόδοσης αλληλούχηση Υπολογισμός σχετικού επιπέδου μεταγράφων με καταμέτρηση των κλώνων που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένο γονίδιο Συχνότητα εμφάνισης συγκεκριμένου EST σε βιβλιοθήκη ESTs είναι μέτρο του επιπέδου έκφρασής του SAGE

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Η αφθονία ενός mRNA συνάγεται μετρώντας πόσες φορές εκπροσωπείται σε ένα δείγμα ΜΙΑ αντίδραση αλληλούχησης επιτρέπει τον εντοπισμό μέχρι και 50 μορίων mRNA

Πέψη με BsmFI και αποδέσμευση των μικρών ετικετών SAGE από τα σφαιρίδια ΕΙΚΟΝΑ 13.7: Tα επίπεδα των mRNA είναι δυνατόν να προσδιοριστούν με την καταμέτρηση μικρών τμημάτων της αλληλουχίας τους, κατά τη μέθοδο της σειριακής ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης (SAGE).

RNA seq

Εφαρμογές μικροσυστοιχιών

1. Προσδιορισμός θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων στο γονιδίωμα Γονιδιακή έκφραση ευκαρυωτών είναι αποτέλεσμα μεταγραφικών παραγόντων. Ποιες είναι οι θέσεις πρόσδεσής τους;; ιχνηλάτηση DNA gel mobility shift assay Όμως, οι προσεγγίσεις αυτές: Μελετούν λίγες θέσεις κάθε φορά in vitro μελέτη δεν αντανακλά πάντα την πραγματικότητα Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP)

«Μονιμοποίηση» επαφών ΕΙΚΟΝΑ 13.8: Με την ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης εντοπίζονται αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και DNA σε ζωντανά κύτταρα.

ΕΙΚΟΝΑ 13.9: Με το πείραμα ChIP-chip εντοπίζονται νέες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. [Ο παράγοντας Rap1 προσδένεται στο DNA και ρυθμίζει την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται σε πολλές σημαντικές κυτταρικές διεργασίες. Έχει τόσο ενεργοποιητική όσο και κατασταλτική δράση]

ΕΙΚΟΝΑ 13.9: Με το πείραμα ChIP-chip εντοπίζονται νέες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων.

2. Εντοπισμός τροποποιήσεων χρωματίνης με ChIP Περιοχές του γονιδιώματος που υφίστανται τροποποιήσεις της δομής της χρωματίνης είναι συνήθως περιοχές μεταγραφικού ελέγχου Αναδιαμόρφωση της δομής της χρωματίνης χημικές τροποποιήσεις aa μεθυλίωση DNA ευαισθησία DNA σε νουκλεάσες

ΕΙΚΟΝΑ 13.10: Η τεχνική ChIP χρησιμοποιείται για το χαρακτηρισμό των τροποποιήσεων των ιστονών στη χρωματίνη των ζωντανών κυττάρων.

Χρησιμοποίηση αντισωμάτων που αναγνωρίζουν καθένα από τα ειδικά aa στην τροποποιημένη και μη τροποποιημένη μορφή για τον προσδιορισμό της κατάστασης της χρωματίνης σε κάθε περιοχή του γονιδιώματος

ΕΙΚΟΝΑ 13.10: Η τεχνική ChIP χρησιμοποιείται για το χαρακτηρισμό των τροποποιήσεων των ιστονών στη χρωματίνη των ζωντανών κυττάρων. Οι ζώνες υποδεικνύουν περιοχές τις περιοχές στις οποίες εντοπίστηκαν οι τροποποιήσεις. Όσο πιο σκούρο είναι το χρώμα μιας ζώνης, τόσο μεγαλύτερη ποσότητα του αντίστοιχου DNA βρέθηκε στο ίζημα κατά την ανοσοκατακρήμνιση της χρωματίνης. Η πλειονότητα των τροποποιήσεων που ανιχνεύτηκαν εντοπίζεται σε γονίδια.

Προσδιορισμός των επιπέδων μεθυλίωσης ακόμα ευκολότερος γιατί δεν χρειάζονται αντισώματα: απομόνωση DNA και πέψη με μίγμα 6 ενζύμων που πέπτουν μόνο μη μεθυλιωμένες CpG απομόνωση μικρών τμημάτων μη μεθυλιωμένων CpG περιοχών με χρωματογραφία υβριδοποίηση των περιοχών αυτών σε μικροσυστοιχία DNA ολόκληρου του γονιδιώματος Παρόμοια και για τον προσδιορισμό των θέσεων υπερευαισθησίας στην DNάση

ΕΙΚΟΝΑ 13.11: Μελέτη της μεθυλίωσης του DNA σε γονιδιωματική κλίμακα. (που σχετίζονται με την ενεργοποίηση της μεταγραφής στις συνθήκες του πειράματος)

3. Χαρακτηρισμός ρυθμιστικών στοιχείων Την εποχή του 1970: Παροδική διαμόλυνση με DNA για τη μελέτη της έκφρασης και των λειτουργιών των γονιδίων Σήμερα: Παροδική διαμόλυνση σε ευρεία κλίμακα καλλιέργεια κυττάρων σε πηγαδάκια πολυκυψελιδικών πιάτων διαμόλυνση κάθε πηγαδιού με πλασμίδιο που περιέχει κάποιον υποκινητή ενός διαφορετικού γονιδίου (υπό τον έλεγχο της λουσιφεράσης) μέτρηση χημειοφωταύγειας

ΕΙΚΟΝΑ 13.12: Πειράματα με γονίδια αναφοράς σε ζωντανά κύτταρα επιτρέπουν τη μέτρηση της ενεργότητας ενός υποκινητή. Ένα πείραμα αυτού του είδους έδειξε ότι περίπου το 10% των ανθρώπινων υποκινητών είναι αμφίδρομοι

4. Συστηματική αδρανοποίηση των γονιδίων του ζυμομύκητα Η μεταλλαξιγένεση παραμένει η θεμελιώδης μέθοδος προσδιορισμού του ρόλου των πρωτεϊνών και των αλληλουχιών του DNA Στοχευμένες μεταλλάξεις Η γνώση της αλληλουχίας των γονιδίων ενός οργανισμού μας δίνει τη δυνατότητα δημιουργίας αδρανοποιητικών μεταλλάξεων σε κάθε γονίδιο S. cerevisiae

"Πλήρης" συλλογή στελεχών στο καθένα των οποίων έχει αδρανοποιηθεί ένα γονίδιο και στη θέση του υπάρχει δείκτης επιλογής Ο δείκτης έχει γνωστές μεθοριακές αλληλουχίες και άρα δυνατότητα PCR ενίσχυσης: μοριακοί γραμμωτοί κώδικες (bar codes)

ΕΙΚΟΝΑ 13.13: Χάρη σε ένα πείραμα λειτουργικής γονιδιωματικής εντοπίστηκαν τα γονίδια που παίζουν σημαντικό ρόλο στον αερόβιο μεταβολισμό στο ζυμομύκητα.

Ευρείας κλίμακα συστηματική ανάλυση της λειτουργίας των γονιδίων: 1/3 των γονιδίων είναι απαραίτητα για την επιβίωση διαφορετικά γονίδια είναι σημαντικά για διάφορες μεταβολικές λειτουργίες διαφορετικά γονίδια είναι σημαντικά για την επιβίωση κάτω από διαφορετικές συνθήκες 466 γονίδια είναι σημαντικά για τον αερόβιο μεταβολισμό του ζυμομύκητα (256 των οποίων δεν ήταν γνωστά) Έχουν δρομολογηθεί πειράματα με σκοπό τη συλλογή από στελέχη ποντικών με αδρανοποιημένα γονίδια

5. Δοκιμή δύο υβριδίων σε γονιδιωματική κλίμακα

ΕΙΚΟΝΑ 13.14: Υψηλής απόδοσης σαρώσεις δύο υβριδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή ενός χάρτη αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πρωτεϊνών του ανθρώπινου γονιδιώματος. Κλωνοποίηση όλων των ORFs σε δύο πλασμιδιακούς φορείς: βιβλιοθήκη "δολωμάτων", βιβλιοθήκη "θηραμάτων" Μετασχηματισμός κυττάρων ζυμομύκητα Σύζευξη, ώστε να βρεθούν στο ίδιο κύτταρο κάθε πλασμίδιο-δόλωμα με κάθε πλασμίδιο-θήραμα Σάρωση, για διαπίστωση έκφρασης γονιδίου αναφοράς Η πλήρης σάρωση και των 6000 γονιδίων θα απαιτούσε τον έλεγχο περισσότερων από 36 εκατ αποικιών για πιθανές αλληλεπιδράσεις Από τα αποτελέσματα πολλών μελετών έχουν δημιουργηθεί «χάρτες αλληλεπιδράσεων» (“interactomes”) για χιλιάδες πρωτεΐνες στο ζυμομύκητα, στο C. elegans, στον άνθρωπο και στον ποντικό.

Από "Ανασυνδυασμένο DNA" Σελίδες 445-476 Από «Γονιδιώματα» Κεφάλαιο 5.3 Κεφάλαιο 6.1