Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας ΕΘΝΙΚΟΝ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διπλωματική εργασία Μαλλούρη Βίκη Α.Μ 220168 ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗΣ ΠΑΡΑΜΟΝΗΣ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ Επιβλέπουσες: Ι. Σ. Παπασιδέρη, Αναπλ. Καθηγήτρια Παν. Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας Φ.Καράμπαμπα, Μονάδα Μεσογειακής Αναιμίας Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο Αθηνών ‘Λαϊκό’

Δομή της παρουσίασης Περιπτώσεις με αυξημένη Ηb F, μεταλλαγές του Αγ γονιδίου (-117 Αγ,4bp) Αναφορά στις μεθόδους Συζήτηση για τις δυο μεταλλαγές και την συμβολή τους στο φαινότυπο. Στην παρουσίαση θα αναφερθώ στην εμβρυική αιμοσφαρίνη και στις καταστάσεις που παρουσιάζεται αυξημένη καθώς και σε δυο μεταλλαγές του Αγ γονιδίου την -117 και 4bp.Ακολούθως θα αναφέρω τις μεθόδου που χρησιμοποιήθηκαν κατα τη διεξαγωγή της διπλωματικής εργασίας και τα τελικά συμπεράσματα που αφορούν στις δυο μελετηθείσες μεταλλαγές.

Το μόριο και η λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Διαταραχές στη δομή της αιμοσφαιρίνης ή την σύνθεσή της οδηγούν σε αιμοσφαιρινοπάθειες

Mεσογειακή αναιμία Aσθένεια στην οποία υπάρχει γενετικά καθορισμένη έλλειψη ή απουσία σύνθεσης μιας από τις αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης. Η πρώτη σε συχνότητα κληρονομική νόσος στην Ελλάδα. 8% τα ετερόζυγα άτομα για β Μ.Α Ετερογενής κατανομή (5-20%)

Τα αιμοσφαιρινικά γονίδια

Oι αιμοσφαιρίνες εκφράζονται σε διαφορετικό χρόνο και από διαφορετικό ιστό  Μεταστροφή Ηb Gower I ζ2ε2 HbGower II α2ε2 Hb Portlandζ2γ2 Hb Fα2Αγ, α2Gγ Hb Aα2β2 Ηb A2 α2δ2

Κατά την γέννηση η HbF αποτελεί το 60-80%. Σταδιακή μείωση μέχρι το 0,5-1%. F-κύτταρα Φυσιολογικός ενήλικας Hb A:96-98% Hb A2:2-3% Hb F< 1%

Περιπτώσεις με αυξημένη Hb F Eρυθροποιητικό στρες δβ-θαλασσαιμία ΗPFH

δβ- θαλασσαιμία Έλλειψη που περιλαμβάνει το β και δ γονίδιο Ομόζυγη κατάσταση: 100% ΗbF Ετερόζυγη κατάσταση: 5-20% HbF (ετεροκυτταρική κατανομή) Στον ελληνικό πληθυσμό απαντάται η δβsic και δβturk

Κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης Ηereditary Persistance of Fetal Hemoglobin Καταστάσεις κατά τις οποίες η έκφραση των εμβρυϊκών γονιδίων Gγ και Αγ διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και στην ενήλικο ζωή,με αποτέλεσμα το ποσοστό της Ηb F να υπερβαίνει το 1% και να κυμαίνεται μεταξύ 10-50%. Ελλειπτικού τύπου Μη ελλειπτικού τύπου Μεταλλαγές που αφορούν στην οικογένεια των β γονιδίων Gγβ+ Αγβ+ Μεταλλαγές που αφορούν άλλες χρωμοσωμικές θέσεις

HPFH Ελλειπτικού τύπού Εκτεταμένες ελλείψεις τμημάτων DNA που περιλαμβάνουν τα δ και β γονίδια αλλά και ρυθμιστικές περιοχές του συμπλέγματος των β γονιδίων Eπίπεδα Ηb F 16%-30% Αφαίρεση συγκεκριμένων τμημάτων DNA φέρνει σε γειτονία τα γ γονίδια με κάποιους ενισχυτές ή τα απομακρύνει από αλληλουχίες silencers.

Μη Ελλειπτικού τύπου Σημειακές μεταλλαγές ή μικρές ελλείψεις στην περιοχή των υποκινητών των δυο γ γονιδίων. Μικρότερα ποσοστά HbF σε σχέση με τις ελλειπτικού τύπου HPFH. Μεταβάλλουν την συγγένεια πρόσδεσης ερυθροειδίκών ή μη ρυθμιστικών πρωτεϊνων.

Η μεταλλαγή -117 Αγ GA Αντικατάσταση γουανίνης από αδενίνη στην θέση -117 του υποκινητή του Αγ γονιδίου Συχνά ονομάζεται ελληνικού τύπου ΗPFH H συχνότερη μεταλλαγή HPFH μη ελλειπτικού τύπου στην Ελλάδα Εμποδίζει την πρόσδεση παραγόντων με κατασταλτική δράση στα γ γονίδια.

Η έλλειψη 4bp (Αγ -225 έως -222) Mη ελλειπτικού τύπου Έλλειψη τεσσάρων βάσεων (AGCA) Εμφανίζεται σε μια μικρή περιοχή επανάληψης της τριπλέτας GCA

Σκοπός της εργασίας Η ανίχνευση των συχνότερων μεταλλαγών στο Αγ γονίδιο (-4bp,-117 GA) σε ενήλικα άτομα στον ελληνικό πληθυσμό που παρουσίαζαν αυξημένη Hb F και η συμβολή τους στα αυξημένα επίπεδα της. H μελέτη της ΗPFH και γενικότερα των μεταλλαγών στα γ γονίδια συμβάλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών, που ενέχονται στη μεταστροφή της έκφρασης των εμβρυϊκών και ενήλικων γονιδίων του ανθρώπου,εφόσον αυτή αποτελεί θεραπευτική προσέγγιση για την Μ.Α.

Δείγματα Μελετήθηκαν 47 δείγματα Ενήλικα άτομα τα οποία χαρακτηρίζονταν από αυξημένα επίπεδα HbF και φυσιολογικούς τους λοιπούς αιματολογικούς δείκτες Ενήλικα άτομα πάσχοντες από β-μεσογειακή αναιμία με σκοπό την πλήρη γονοτυπική ανάλυση στο Αγ γονίδιο.

Μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν Απομόνωση DNA από λευκοκύτταρα περιφερειακού αίματος Ενίσχυση συγκεκριμένης αλληλουχίας του Αγ υποκινητή με Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-PCR Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση σε ακρυλαμίδη με κλίση αποδιατακτικών παραγόντων-DGGE Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Έλεγχος ποιότητας του DNA Τα δείγματα επιλέχθηκαν μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης Θέση 4 ΦΧ-174

Αποτελέσματα PCR Hλεκτροφόρηση προιόντος PCR, FAG Αγ μεγέθους 681bp Hλεκτροφόρηση προιόντος PCR, ΗPFAG Aγ μεγέθους 327bp

Αποτελέσματα Από εφαρμογή της DGGE→ στον υποκινητή του Αγ: -117 Αγ Νl (μάρτυρας) Mάρτυρας -117Αγ/4bp Mάρτυρας -117Αγ/Νl -117 Αγ /Νl Mάρτυρας 4bp/Νl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl 4bp/Νl 4bp/Νl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl

Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες 109 bp 181 bp 37 bp HPFAG 327 bp 290 bp θέση αναγνώρισης του MseI Γονίδιο με την έλλειψη 4 bp: Προϊόν PCR: Φυσιολογικό γονίδιο: Γονίδιο με τη μεταλλαγή –117 GA Aγ: Πέψη με το ένζυμο MseI

Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Πέψη με το ένζυμο Fnu4HI 42 bp 173 bp 112 bp Φυσιολογικό γονίδιο: Μεταλλαγμένο γονίδιο: 211 bp 112 bp Προϊόν PCR: HPFAG 327 bp 4bp/4bp ΦΧ-174 Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl 4bp/Nl

Oμάδες δειγμάτων Φυσιολογικά και απλά ετερόζυγα άτομα για β μεταλλαγή Φυσιολογικά και απλά ετερόζυγα άτομα για β μεταλλαγή Άτομα με ενδιάμεση Μ.Α (ομόζυγα και διπλά ετερόζυγα για β μεταλλαγές) Πάσχοντες με Μ.Α

Ανίχνευση της μεταλλαγής -117 Αγ GA σε φυσιολογικό άτομο Α/Α δείγματος Ηb (g/dl) HCT RBC MCH (pg) MCV (fl) ΗbA2 (%) HbF (%) Fe Φερ Γονότυπος β γονιδίων Αγ γονιδίων 46 17,6 52,3 5710 30,9 91,7 1,5 1,7 14,6 17,1 (όχι δβ-Sic όχι δβ turk) -117 Αγ/Nl

Ανίχνευση της 4bp μεταλλαγής σε άτομα με ενδιάμεση Μ.Α Α/Α δείγματος Ηb (g/dl) HCT RBC MCH (pg) MCV (fl) ΗbA2 (%) HbF (%) Fe Φερ Γονότυπος β γονιδίων Αγ γονιδίων 24 7,5 23,3 3110 24,1 74,9 3,8 4,5 +1570/IVSI-1 4bp/Nl 25 9,1 29,1 3410 26,7 85,3 2,5 88,6 110 β39/-87 34 9,3 30,2 5480 17 55,1 6 8,4 65 2,2 IVSI-6/IVSI-6 38 4bp/4bp 40 12,4 39,9 6300 63,3 6,1 15,9 84 43 β39/TER-6

Ανίχνευση της 4bp μεταλλαγής σε ετερόζυγα άτομα για το β γονίδιο Α/Α δείγματος Ηb (g/dl) HCT RBC MCH (pg) MCV (fl) ΗbA2 (%) HbF (%) Fe Φερ Γονότυπος β γονιδίων Αγ γονιδίων 41 15,4 45,6 5400 28,5 84,4 Poly A/Nl 4bp/Nl 42 13,1 40,8 23,1 72 3,6 0% 43 13,8 42,8 5450 25,3 78,5 3,3

Ανίχνευση της 4bp μεταλλαγής σε πάσχοντες από μείζων Μ.Α Α/Α δείγματος Γονότυπος β γονιδίων Αγ γονιδίων 18 FSC6/cd39 4bp/Nl 21 Cd39/IVSI-110

Δείγματα στα οποία δεν ανιχνεύθηκε γνωστή μεταλλαγή Α/Α δείγματος Ηb (g/dl) HCT RBC MCH (pg) MCV (fl) ΗbA2 (%) HbF (%) Fe Φερ Γονότυπος β γονιδίων Αγ γονιδίων 47 9,2 29 2850 32,2 101,8 1,6 6,5 80 (όχι δβSic-δβturk) Nl

Συμπεράσματα Η μεταλλαγή -117 Αγ βρέθηκε σε ένα μόνο άτομο με φυσιολογικό αιματολογικό φαινότυπο και αυξημένη F όπως άλλωστε αναμένεται. Σε καμία περίπτωση πασχόντων από ενδιάμεση ΜΑ δεν αποδείχθηκε ότι η αυξημένη ΗbF την οποία παρουσίαζαν οφειλόταν στην μεταλλαγή –117 Αγ. Μια πιθανή συμβολή της 4bp στην αύξηση της Ηb F θα σχετίζεται με δευτερεύοντες μηχανισμούς και με συγκεκριμένους απλότυπους ενώ δρα κύρια ως πολυμορφισμός.

Ευχαριστίες Ι. Σ. Παπασιδέρη , Aναπλ. Καθηγήτρια Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής Δρ. Φωτεινή Καράμπαμπα, εργαστήριο Προγεννητικής Διάγνωσης του μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας. Δρ. Αφροδίτη Λουτράδη-Αναγνώστου, Διευθύντρια της μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας του Π.Γ.Ν Αθηνών «Λαϊκό» Το επιστημονικό και τεχνολογικό προσωπικό του εργαστηρίου (Δρ. Μ. Μπουσίου, Δρ. Κ. Σινοπούλου, κ.Ε.Λάλου κ. Π. Μελίστα, κ. Ζ. Μουζάκη, κ. Ν. Σακελαρίου, κ. Γ. Τσίτσου, κ.Δ.Πίπη)

Ευχαριστώ για την προσοχή σας!