μέθοδοι προσδιορισμού στο βιοχημικό εργαστήριο

φωτομετρία φωτομετρία ονομάζεται η μέτρηση της έντασης του φωτός. το φως είναι μια ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία με μήκος κύματος (λ) από 200 έως 2000 nm. οι ορατές από το ανθρώπινο μάτι ακτινοβολίες βρίσκονται στην περιοχή από 380 (ιώδες) έως 750 nm (ερυθρό).

φάσματα Φάσμα λευκού φωτός ακτινοβολίες με λ < 380 nm ονομάζονται υπεριώδεις και ανιχνεύονται λόγω της επίδρασης πάνω στο φωτογραφικό φιλμ. ακτινοβολίες με λ > 750 nm ονομάζονται υπέρυθρες και ανιχνεύονται λόγω της θερμότητας που ακτινοβολούν. το λευκό φως είναι σύνθετο και περιέχει όλες τις ορατές ακτινοβολίες. Φάσμα λευκού φωτός

αρχές της φωτομετρίας 1ος νόμος: εάν αφήσουμε μία δέσμη φωτός να περάσει μέσα από κάποιο διαφανές υλικό (π.χ. κάποιο διάλυμα), μέρος της ακτινοβολίας απορροφάται με αποτέλεσμα την μείωση της έντασης του φωτός.

αρχές της φωτομετρίας * ή απορρόφηση ή οπτική πυκνότητα 2ος νόμος (Lambert – Beer): η απορρο-φητικότητα* ενός διαλύματος μιας ουσίας, είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση της ουσίας. * ή απορρόφηση ή οπτική πυκνότητα

γενική αρχή φωτομετρίας αν έχω ένα διάλυμα κάποιας ουσίας γνωστής συγκέν-τρωσης (πρότυπο διάλυμα) και ένα δείγμα άγνωστης συγκέντρωσης, μπορώ να μετρήσω με τη βοήθεια ενός φωτομέτρου τις οπτικές πυκνότητες των 2 διαλυμάτων και με μια απλή αναγωγή (αφού τα ποσά είναι ανάλογα) να υπολογίσω τη συγκέντρωση του δείγματος.

βασικά μέρη φωτομέτρου η πηγή φωτός συνήθως είναι μια κοινή λάμπα ο μονοχρωμάτορας είναι μια διάταξη φακών και πρισμάτων που μας επιτρέπει να επιλέγουμε ένα μήκος κύματος στην κυβέτα βάζουμε το διάλυμα που φωτομετρούμε το φωτοκύτταρο μετατρέπει την ένταση του φωτός σε ρεύμα τέλος η συσκευή ένδειξης μας δείχνει το τελικό αποτέλεσμα το οποίο είναι η ένταση του φωτός που απορροφήθηκε.

φασματοφωτόμετρο σύγχρονο φωτόμετρο υπεριώδους – ορατής με ψηφιακή ένδειξη του αποτελέσματος και άλλες ψηφιακές ευκολίες.

τεχνική φωτομέτρησης ετοιμάζουμε σειρά σωληναρίων στα οποία θα γίνει η αντίδραση για τον προσδιορισμό της ουσίας.

τεχνική φωτομέτρησης σημειώνουμε το ένα σωληνάριο με το γράμμα Τ το οποίο αντιστοιχεί με το Τυφλό. στο άλλο σωληνάριο σημειώνουμε την ένδειξη Π και εκεί θα βάλουμε το δείγμα γνωστής συγκέντρωσης ή αλλιώς Πρότυπο ή Standard. στα υπόλοιπα σωληνάρια πρόκειται να δουλέ-ψουμε τα δείγματα μας στα οποία επιθυμούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση της ου-σίας και σημειώνουμε αντίστοιχα Δ1, Δ2 κλπ.

τεχνική φωτομέτρησης

τεχνική φωτομέτρησης εκτελούμε με σχολαστικότητα τις οδηγίες της μεθόδου όσον αφορά τη παρασκευή των διαλυμάτων και την ολοκλήρωση της χημικής αντίδρασης στο κάθε σωληνάριο. η χημική αντίδραση στην οποία στηρίζεται η μέθοδος (αρχή της μεθόδου) δίνει πάντοτε ένα έγχρωμο προϊόν του οποίου το η ένταση του χρώματος είναι πάντοτε ανάλογη της συγκέντρωσης της ουσίας.

τεχνική φωτομέτρησης αν υποθέσουμε ότι έχουμε ένα αντιδρα-στήριο και ένα εξεταστέο δείγμα τότε στη σειρά των σωληναρίων τα διαλύματα θα μπουν ως εξής: Τ Π Δ Αντιδραστήριο √ Πρότυπο διάλυμα -   Εξεταστέο (συνήθως ορός αίματος)

τεχνική φωτομέτρησης μετά την ολοκλήρωση της χημικής αντί-δρασης αρχίζει η φωτομέτρηση: επιλέγουμε μήκος κύματος βάζουμε το τυφλό και μηδενίζουμε το όργανο βάζουμε το πρότυπο και καταγράφουμε την οπτική πυκνότητα που μας δείχνει το όργανο βάζουμε ένα – ένα τα δείγματα και καταγράφουμε τις οπτικές πυκνότητές τους. τέλος κάνουμε τους υπολογισμούς.

τεχνική φωτομέτρησης αν η συγκέντρωση του προτύπου είναι CΠ και μετρήσαμε στο φωτόμετρο απορρόφηση ΑΠ ενώ στο άγνωστο δείγμα μετρήσαμε απορρόφηση ΑΔ, τότε η συγκέντρωση της ουσίας στο άγνωστο δείγμα θα είναι: