Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων

Ορισμός Ενζύμου Μια πρωτεϊνη που έχει την ιδιότητα της καταλύσης, δηλαδή της μετατροπής ενός υποστρώματος σε προϊόν

Κατάταξη Ενζύμων με βάση τον όγκο παραγωγής και αγοράς Μεγάλου όγκου ή βιομηχανικά ένζυμα (industrial enzymes) Μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίας ένζυμα (high added value enzymes) Εξωκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Χαμηλή καθαρότητα Μεγάλες ποσότητες παραγωγής Φθηνό κόστος παραγωγής και αγοράς Ενδοκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Υψηλή καθαρότητα Μικρές ποσότητες παραγωγής Ακριβό κόστος παραγωγής και αγοράς

Μικροβιακής Προέλευσης Προέλευση Ενζύμων Ζωικής Προέλευσης Λιπάση (πάγκρεας χοίρου, βιομηχανία καλλυντικών) Θρυψίνη (πάγκρεας μόσχου και χοίρου, επεξεργασία δέρματος) Αφυδρογονάσες (καρδιακό ή σκελετικό μυ θηλαστικών, διαγνωστική και αναλυτική επιστήμη) Φυτικής Προέλευσης Παπαΐνη (Carica Papaya, ζυθοποιία) Οξαλοξική οξειδάση (ρίζες κριθαριού, προσδιορισμός οξαλοξικού οξέος) Υπεροξειδάση (ραφανίδα, ένζυμο δείκτης ενζυμικών αντιδράσεων) Μικροβιακής Προέλευσης Περιοριστικά ένζυμα (διάφοροι μικροοργανισμοί, μοριακή βιολογία)

Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Τι είναι; Συστήματα παραγωγής πρωτεϊνών ως αποτέλεσμα έκφρασης ανασυνδυασμένων γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά πολυπεπτίδια Πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης διατηρούν και εκφράζουν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα γονίδια στα συστήματα έκφρασης Συστήματα έκφρασης: προκαρυωτικοί και ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί, κυτταροκαλλιέργειες ανώτερων οργανισμών, φυτά, ζώα, cell-free συστήματα έκφρασης...

Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Cell-free Insect Yeast Bacterial Transgenic animals Transgenic plants Mammalian

Ετερόλογη Έκφραση: Τι χρειαζόμαστε;

Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Κύριες εφαρμογές: Παραγωγή πρωτεϊνών που συναντώνται σε χαμηλές ποσότητες στις φυσικές πηγές, για άμεση απομόνωση και λειτουργική-δομική τους ανάλυση. Βιομηχανική παραγωγή πρωτεϊνών για βιοφαρμακευτική χρήση. Χαρακτηρισμό πρωτεϊνών που έχουν ανιχνευθεί μέσω τεχνικών reverse genetics. Δομική και λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας τεχνικές μεταλλαξογέννεσης Παραγωγή πρωτεϊνών με νέες ιδιότητες εφαρμόζοντας τεχνικές πρωτεϊνικής μηχανικής

Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Escherichia coli: το πιο χρησιμοποιημένο βακτήριο για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Γρήγορο, φθηνό, εύκολο (όταν δουλεύει) Εύκολη κλωνοποίηση και γενετική τροποποίηση Μικρός κόστος καλλιέργειας Γρήγορη ανάπτυξη και έκφραση

Γενετικά ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans Aspergilus niger, Aspergillus oryzae, Pishia pastoris ……… Τεχνική κλωνοποίησης ανασυνδυασμένου DΝΑ Επιλογή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης Επαγωγή υπερέκφρασης Αντίδραση συγκόλλησης Μετασχηματισμός Κυττάρων έκφρασης PCR στο αντίστοιχο γένωμα

Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Βασικά βήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών: Απομόνωση και πολλαπλασιασμός του γονιδίου στόχου (PCR) Μεταφορά του γονιδίου σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης (pET) Μετασχηματισμός E. coli κυτταρικής σειράς έκφρασης (Bl21DE3) Μικρής κλίμακας υπερέκφραση Έλεγχος έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (ενζυμική δοκιμή, western blot) Μεγάλης κλίμακας υπερέκφραση Απομόνωση πρωτεΐνης (Χρωματογραφία)

Παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών μέσω γενετικά ανασυνδυασμένων μικροοργανισμών Πρωτεΐνη Παθήσεις α1-Αντιθρυψίνη Εμφύσημα Αδρενοκοτρικοτροπική ορμόνη Ρευματικές Παθήσεις Παράγοντας VIII Αιμοφιλία Παράγοντας ΙΧ Ενδορφίνες Πόνος Αιμογλοβίνη Αναιμία Ινσουλίνη Διαβήτης Λεμφοτοξίνη Καρκίνος Αυξητική ορμόνη Αναπτυξιακά προβλήματα Ιντερλευκίνες Καρκίνος, Ανοσολογικές παθήσεις Ιντερφερόνες (α, β, γ) Ιώσεις, Καρκίνος Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας Εγκαύματα Νευρικός αυξητικός παράγοντας Τραύματα νευρώνων

(Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Οργανισμός (Πηγή πρωτεΐνης) Ανιούσα Επεξεργασία (Έκφραση πρωτεΐνης) Κατιούσα Επεξεργασία (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Καθαρό Πρωτεϊνικό Παρασκεύασμα

Κατιούσα Επεξεργασία Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμός Στερεών και Υγρών Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Τελικό Στάδιο Μορφοποίηση Προϊόντος

Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Φυγοκέντρηση Ίζημα : Ενδοκυτταρικές, μεβρανικές πρωτεΐνες Υπερκείμενο : Εξωκυτταρικές πρωτεΐνες Φυγοκέντρηση σε ειδικά δοχεία Φυγοκέντρηση συνεχούς ροής

Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Υπερδιήθηση: 0,002-0.2μm Διήθηση Μικροδιήθηση : 0,005-2μm

Διάρρηξη Κυττάρων Μη Μηχανικές Τεχνικές Ωσμωτικό σοκ Αλκαλική λύση (pH 11-12,5) Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (απορρυπαντικά) Οργανικοί διαλύτες (τολουόλιο, ακετόνη) Ενζυμική λύση (λυσοζύμη) Πάγωμα-ξεπάγωμα Μηχανικές Τεχνικές Εφαρμογή υπερήχων Εφαρμογή υψηλής πίεσης Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους

Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Εφαρμογή υπερήχων Sonicator

Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Εφαρμογή υψηλής πίεσης French Press Cell Press

Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους Glass beads

Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Ωσμωτικό σοκ Μεταφορά κυττάρων από ισοτονικο διάλυμα σε υποτονικό (απιονισμένο νερό) Χρησιμοποιειται κυρίως σε κύτταρα θηλαστικών. Για μύκητες και βακτήρια πρέπει να εχει προηγηθεί άλλη τεχνική εξασθένισης του κυτταρικού τοιχώματος για να χρησιμοποιηθει η τεχνική του Ωσμωτικού Σοκ.

Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Πάγωμα ξεπάγωμα Freeze-thaw Εναλλαγές κυτταρικού δ/τος από ξηρό πάγο (-78οC) στους 37οC. Χρησιμοποιειται κυρίως σε κύτταρα θηλαστικών και βακτήρια.

Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Ενζυμική λύση με χρήση λυσοζύμης Υδρόλυση στρώματος πεπτιδογλυκάνης που περιβάλλει τα βακτήρια Χρησιμοποιειται κυρίως σε Gram+ βακτήρια και σε συνδυασμό με άλλη μεθοδο διάρρηξης (απορρυπαντικο, ωσμωτικό σοκ)

Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Αλκαλικη λύση Χρήση διαλυμάτων NaOH Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (οργανικοί διαλύτες, απορρυπαντικά) Διαλυτοποίηση φωσφολιπιδίων κυτταροπλασματικής μεμβράνης Απαιτείται άμεση απομάκρυνση τους λόγω πρόκλησης αποδόμησης των πρωτεϊνών.

Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Κατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες Κατακρήμνιση σε υδατικά διφασικά συστήματα Θερμική Επεξεργασία Κατακρήμνιση με άλατα Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων (πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπτομυκίνη, βρωμιούχο κετυλο τριμεθυλαμμώνιο, πρωταμίνη, δεοξυριβονουκλεάση)

Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Χρωματογραφία Διαπερατότητας (gel filtration) http://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής (Ion exchange chromatography) http://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8 Χρωματογραφία Συγγένειας (Affinity chromatography) http://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y Χρωματογραφία Υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (Hydrophobic interaction) http://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y

Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Fast protein liquid chromatography FPLC

Τελικό Στάδιο Μορφοποίησης Προϊόντος Απομάκρυνση μικρομοριακών ουσιών (υπερδιήθηση, χρωματογραφία διαπερατότητας) Προσθήκη σταθεροποιητών ενζυμικής ενεργότητας (γλυκερόλη, άλατα, υπόστρωμα, αλβουμίνη…) Ποιοτικός έλεγχος πρωτεϊνών (ανάλογα με τις προδιαγραφές χρήσεις)

Minotech Biotechnology Παραγωγική μονάδα του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας απο το 1987 (πιστοποίηση IS0 9001:2008) Απομόνωση πρωτεϊνών από αγρίου τύπου μικροοργανισμούς ή ετερόλογα εκφρασμένων σε βακτήρια. Προϊόντα: Restriction Enzymes • DNA Modifying Enzymes • Nucleic Acids and Markers • Cytokines • Specialty Enzymes • Antibodies • Reagents