Συνεστιακή Μικροσκοπία Γώγουλος Ζαχαρίας Γκόνης Αργύρης Σ.Ε.Μ.Φ.Ε. Σεμινάριο Φυσικής 2008

Εισαγωγικά περί μικροσκοπίας Η συμβατική θεώρηση του οπτικού μικροσκοπίου σαν ένα όργανο για τη μελέτη στερεωμένων δειγμάτων ιστού Διάφορες ανακαλύψεις έδωσαν στους επιστήμονες τη δυνατότητα να αυξήσουν την ικανότητα παρατήρησης και καταγραφής και να εφαρμόσουν τις τεχνικές αυτές σε προβλήματα τα οποία παλαιότερα θεωρούνταν δυσεπίλυτα Σεμινάριο Φυσικής 2008

Ένα Απεικονιστικό Σύστημα Μικροσκοπίας αποτελείται από Μία απεικονιστική διάταξη, που μπορεί να είναι ένα μικροσκόπιο απλό ή φθορισμού για απεικόνιση σε δύο ή τρεις διαστάσεις, Έναν ή περισσότερους ιχνηθέτες φθορισμού, για την επισήμανση και παρακολούθηση των αντίστοιχων κυτταρικών δομών και λειτουργιών. Μία συσκευή ανίχνευσης του φθορισμού, όπως μία CCD camera ή ένας φωτοπολλαπλασιαστής και Κατάλληλο λογισμικό για την καταγραφή, ανάλυση και επεξεργασία των παρατηρούμενων εικόνων Σεμινάριο Φυσικής 2008

Τι είναι ο φθορισμός? Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πλεονεκτήματα της μικροσκοπίας φθορισμού? Μπορούμε να συνδέσουμε φθοριούχα μόρια χρωστικών ουσιών με συγκεκριμένα μέρη του δείγματός μας Δυνατότητα χρήσης διαφόρων τύπων χρωστικών ουσιών Με την αλλαγή του φωτός διέγερσης, μπορούμε να αναγκάσουμε έναν τύπο χρωστικής ουσίας να φθορίζει και έπειτα άλλον, για να διακρίνουμε δύο διαφορετικά μέρη του δείγματός μας. Σεμινάριο Φυσικής 2008

Επιφανειακά κύτταρα γλυκοπρωτεϊνης Σεμινάριο Φυσικής 2008

Είδη μικροσκοπίων φθορισμού Μικροσκόπιο με φωτισμό διέλευσης πλήρους πεδίου Μικροσκόπιο φθορισμού με προσπίπτων φωτισμό Σεμινάριο Φυσικής 2008

Αρχή λειτουργίας μικροσκοπίου πλήρους πεδίου Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πλεονεκτήματα Απλή τροποποίηση ενός οπτικού μικροσκοπίου φωτεινού πεδίου με τη χρήση δύο φίλτρων Δυνατότητα χρήσης αντικειμενικών φακών με μεγάλο αριθμητικό άνοιγμα Σεμινάριο Φυσικής 2008

Μειονεκτήματα Δύσκολη ευθυγράμμιση των 2 φακών με διαφορετικούς οπτικούς άξονες Η εστίαση των ακτίνων διέγερσης από τον συγκεντρωτικό φακό στο δείγμα Η εστίαση για την παρατήρηση του φθορισμού Σεμινάριο Φυσικής 2008

Μικροσκόπιο φθορισμού με προσπίπτων φωτισμό Σεμινάριο Φυσικής 2008

Διχρωϊκό κάτοπτρο Καθρέπτης με επικάλυψη από ειδικό μείγμα Το διχρωϊκό κάτοπτρο προκαλεί την ανάκλαση του διεγείροντος φωτός προς το δείγμα, αφού είναι μικρότερου μήκους κύματος, και επιτρέπει τη διέλευση του εκπεμπόμενου φθορισμού προς τους προσοφθάλμιους φακούς. Υψηλή ανάκλαση 45 μοιρών για φως συγκεκριμένου μήκους κύματος Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πλεονεκτήματα προσπίπτοντως φωτισμού Η δυνατότητα συνδυασμού του με συμβατικές διαδικασίες οπτικής μικροσκοπίας όπως η αντίθεση φάσης (phase contrast), η χρήση πολωμένου φωτός και η αντίθεση διαφορικής συμβολής (differential interference contrast). Το διχρωϊκό κάτοπτρο σε συνδυασμό με φίλτρα συμβολής για τη διέγερση και την εκπομπή παρέχει πολύ καλή αντίθεση ακόμη και σε δείγματα με πολύ ασθενή φθορισμό αφού αξιοποιείται όλο το άνοιγμα του αντικειμενικού φακού. Επιπλέον, ο φθορισμός από παχύτερα δείγματα είναι πιο φωτεινός συγκρινόμενος με τη μικροσκοπία φθορισμού διέλευσης, καθώς το φως της διέγερσης δεν πρέπει να περάσει μέσα από όλο το δείγμα Η ευαισθησία αλλά και η συμβατότητα τους με τις άλλες μεθόδους διέλευσης έχουν καθιερώσει την τεχνική του προσπίπτοντος φωτισμού ως την επικρατέστερη διάταξη μικροσκοπίας φθορισμού Σεμινάριο Φυσικής 2008

Συνεστιακό Μικροσκόπιο Φθορισμού Σεμινάριο Φυσικής 2008

Διαφορά συνεστιακής μικροσκοπίας με μικροσκοπία φθορισμού Το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με laser έρχεται να λύσει ένα από τα βασικότερα προβλήματα της συμβατικής μικροσκοπίας φθορισμού, όπου το δείγμα ακτινοβολείται ολόκληρο από τη δέσμη διέγερσης και έτσι όλο το δείγμα φθορίζει συγχρόνως. Φυσικά η μεγαλύτερη ένταση του διεγείροντος φωτός είναι στο εστιακό επίπεδο του φακού αλλά και τα υπόλοιπα μέρη του δείγματος δέχονται ένα μέρος από το φως αυτό και φθορίζουν. Αυτό συνεισφέρει σε ένα ασαφές υπόβαθρο στην τελική εικόνα (οπτικός θόρυβος). Προσθέτοντας την ίριδα το πρόβλημα αυτό λύνεται. Επειδή το εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού του μικροσκοπίου δημιουργεί την εικόνα εκεί όπου είναι η ίριδα τα δύο αυτά σημεία ονομάζονται συζευγμένα. Σεμινάριο Φυσικής 2008

Ιδιότητες της ίριδας Η ίριδα ανίχνευσης απορρίπτει το φως πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο Αν μειωθεί το μέγεθος της ίριδας ελαχιστοποιείται το βάθος πεδίου και συλλέγονται όλα τα εκπεμπόμενα φωτόνια Σεμινάριο Φυσικής 2008

Δυνατότητα για ανίχνευση δύο διαφορετικών μηκών κύματος φθορισμού Σεμινάριο Φυσικής 2008

Το εστιακό επίπεδο επιλέγεται μέσω ενός κινητήρα υψηλής ακρίβειας, ελεγχόμενο από υπολογιστή, μετακινώντας την αντικειμενοφόρο πλάκα. Κατά αυτόν τον τρόπο, μπορούμε να πάρουμε μια ακολουθία από διδιάστατες εικόνες σε διαφορετικό βάθος στο δείγμα, οι οποίες μας δίνουν μια τρισδιάστατη απεικόνιση του αντικειμένου Στα σύγχρονα μικροσκόπια σάρωσης με laser η ευθυγράμμιση των οπτικών, η επιλογή του μήκους κύματος και της ισχύος του laser, η τοποθέτηση των φίλτρων, οι κινήσεις της αντικειμενοφόρου πλάκας και των γαλβανομετρικών κατόπτρων ελέγχονται όλα από υπολογιστή Σεμινάριο Φυσικής 2008

Διάγραμμα ροής πληροφορίας σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με laser Σεμινάριο Φυσικής 2008

Σύγκριση Ψηφιακό απεικονιστικό σύστημα με τη χρήση CCD camera Συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με laser Καταγράφει μεμονωμένα κύτταρα, κυτταρικό πληθυσμό ή κύτταρα σε μία λεπτή τομή ενός ιστού. Διακριτική ικανότητα μέχρι 0.3-0.4 μm στο (x,y) επίπεδο ενώ κατά τον z άξονα η διακριτική ικανότητα είναι περιορισμένη H λήψη εικόνων γίνεται κάθε 1-2 s και απαιτούνται ακριβότερα συστήματα ώστε η λήψη να μπορεί να γίνει σε ρυθμούς video Καταγραφή διπλής εκπομπής απαιτεί τη χρήση δύο καμερών Καταγράφει και κύτταρα σε ιστό χωρίς αυτός να έχει κοπεί σε λεπτές τομές, διαδικασία η οποία είναι δύσκολη και όχι πάντα επιτυχής 0.2 x 0.2 x 0.6μm (x,y,z) Σάρωση γραμμής σε ms, σάρωση σε δύο διαστάσεις από ms μέχρι s και για σάρωση τριών διαστάσεων από s μέχρι min Απεικόνιση χρωμοφόρων τόσο με διπλή διέγερση όσο και με διπλή εκπομπή είναι εύκολο να πραγματοποιηθεί Σεμινάριο Φυσικής 2008

Τα πλεονεκτήματα της συνεστιακής μικροσκοπίας Μεγάλη διακριτική ικανότητα σε σχέση με άλλα ψηφιακά απεικονιστικά μικροσκόπια λόγο της μικρότερης περιοχής εστίασης Ταχύτερη χρονική διακριτική ικανότητα Ευκολότερος προσδιορισμός για τον z άξονα Σημαντική μείωση «οπτικού θορύβου» λόγο μέσου και λόγο απευθείας φθορισμού(φως δωματίου) Σεμινάριο Φυσικής 2008

Ιχνηθέτες φθορισμού Τι είναι? Είναι ένα μικρό μόριο το οποίο παρέχει πληροφορίες για την περιορισμένη περιοχή στην οποία βρίσκεται Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πως εισέρχονται? Με μικροέγχυση Με μια χημική μορφή τους η οποία να μπορεί να διαπερνά τη κυτταρική μεμβράνη Σεμινάριο Φυσικής 2008

Κατηγορίες χρωμοφόρων φθορισμού Σταθερού μήκους κύματος Μεταβλητού μήκους κύματος Σεμινάριο Φυσικής 2008

Εκτεταμένη εστίαση της εικόνας, μέσω των καρδιακών myocytes χαρακτηρισμένα με rhodamine-phalloidin οποία ετικέτες F-ακτίνης Σεμινάριο Φυσικής 2008

Εικόνες εμβρυϊκών κυττάρων καρκίνωμα fluorescently βάφονται για vinculin (πράσινο) και ακτίνης (κόκκινο) Σεμινάριο Φυσικής 2008

Κύτταρα καγκουρό-αρουραίων που λεκιάζουν με fluorescein phalloidin (για να λεκιάσουν τις ίνες ακτινίου) και iodide propidium (για να λεκιάσουν το DNA και τα χρωμοσώματα). Σεμινάριο Φυσικής 2008

Διέγερση και εκπομπή χρωμοφόρων Τα χρωμοφόρα φθορισμού έχουν χαρακτηριστικά φάσματα διέγερσης και φθορισμού. Ο χρόνος απορρόφησης (10^-15ms) Ο χρόνος ζωής του φθορισμού (10^-8s) Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πίνακας 1: Μέγιστα Διέγερσης και Εκπομπής Ιχνηθετών Φθορισμού και οι Αντίστοιχες Κυτταρικές Λειτουργίες που καταγράφουν Ιχνηθέτες Abs Em Κυτταρική λειτουργία (nm) BCECF-AM 488 535 pHi JC-1 475 >510 Δυναμικό μιτοχονδρίων Fluo-3 530 Ca2+ Acridine Orange 500 526 Βαθμίδωση πρωτονίων H2DCFDA 520 Ενεργές ρίζες (ROS) Propidium Iodide 493 637 Κυτταρική βιωσιμότητα Σεμινάριο Φυσικής 2008

Γραμμικότητα-Φωτεινότητα Η ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του χρωμοφόρου Η φωτεινότητα ενός χρωμοφόρου εξαρτάται από δύο χαρακτηριστικά του χρωμοφόρου: -      Το συντελεστή απορρόφησης (extinction coefficient), ε που εκφράζει την πιθανότητα της απορρόφησης και -      Τη κβαντική του απόδοση (quantum yield), φ, δηλαδή το λόγο των κβάντα που εκπέμφθηκαν προς αυτά τα οποία απορροφήθηκαν, που εκφράζει την ικανότητα του χρωμοφόρου να μετατρέπει το φως που απορροφά σε φθορισμό. Σεμινάριο Φυσικής 2008

Επιδράσεις του περιβάλλοντος στους ιχνηθέτες Η φωτοκαταστροφή, η οποία προκαλείται από παρατεταμένο φωτισμό του χρωμοφόρου με το μήκος κύματος διέγερσης του Συνέπεια δημιουργία τοξικών προϊόντων και καταστροφή του ιστού Μείωση της έντασης του φθορισμού και συνεπώς λανθασμένα ποσοτικά συμπεράσματα Σεμινάριο Φυσικής 2008

Τι είναι ο φωτοπολλαπλασιαστής και από τι αποτελείται Ο φωτοπολλαπλασιαστής είναι ένας φυσικός ενισχυτής ο οποίος μετατρέπει την φωτεινή ακτινοβολία σε παλμούς ρεύματος Κάθοδος(V<0), δύνοδοι(ηλεκτρόδια), άνοδος(V=0) Η επιφάνεια των δυνόδων έχει επικάλυψη από φώσφορο Σεμινάριο Φυσικής 2008

Ανίχνευση εικόνας-Φωτοπολλαπλασιαστής Σεμινάριο Φυσικής 2008

Βασικά χαρακτηριστικά φωτοπολλαπλασιαστή Η σταθερότητα του συντελεστή ενίσχυσης g Η κβαντική απόδοση (quantum efficiency) της φωτοκαθόδου Το transit time spread (TTS) το οποίο εκφράζει τη διακύμανση στον παλμό εξόδου του φωτοπολλαπλασιαστή όταν φωτίζεται από συνάρτηση δέλτα Η τάση η οποία εφαρμόζεται είναι πολύ σημαντική καθώς καθορίζει τόσο τη σταθερότητα στην ενίσχυση όσο και στη χρονική απόκριση του φωτοπολλαπλασιαστή Σεμινάριο Φυσικής 2008

Μέθοδοι ανάγνωσης του σήματος του φωτοπολλαπλασιαστή Ο φωτοπολλαπλασιαστής παράγει μία σειρά τυχαίων και μικρής διάρκειας παλμών ρεύματος (50-100 ns) των οποίων η μέση συχνότητα, αποτελεί μέτρο του προσπίπτοντος φωτός. Άμεσο αποτέλεσμα αυτού είναι ότι ο φωτοπολλαπλασιαστής δεν μπορεί να δώσει στιγμιαίες μετρήσεις για το επίπεδο του φωτός αλλά οι παλμοί των φωτονίων θα πρέπει να συσσωρευτούν για μία συγκεκριμένη χρονική περίοδο Μέθοδος μέτρησης φωτονίων (photon counting) Μέθοδο ολοκλήρωσης του παλμού εξόδου Σεμινάριο Φυσικής 2008

Μέθοδοι μέτρησης του φωτός με έναν φωτοπολλαπλασιαστή Μέθοδοι μέτρησης του φωτός με έναν φωτοπολλαπλασιαστή. Α) Μέθοδος μέτρησης φωτονίων (photon counting). B) Μέθοδος ολοκλήρωσης του παλμού εξόδου του φωτοπολλαπλασιαστή (analogue integrator) Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πλεονεκτήματα Μέτρηση φωτονίων Ολοκλήρωση του παλμού εξόδου Πλεονέκτημα ως προς την ευαισθησία και το δυναμικό εύρος Ελάττωση του θορύβου Δεν επηρεάζεται από το dark current λόγο της ύπαρξης του διευκρινιστή Ικανοποιητική απόδοση για πολλές εφαρμογές όπου δεν απαιτείται το πλήρες δυναμικό εύρους του μετρητή Σεμινάριο Φυσικής 2008

Το πρόγραμμα ANALYZE Το ANALYZE είναι ένα ολοκληρωμένο οπτικό-διαγνωστικό εργαστήριο στην οθόνη ενός ηλεκτρονικού υπολογιστή.  Απαρτίζεται από 60 και πλέον ανεξάρτητα, αλλά σαφώς συνεργαζόμενα προγράμματα και 500 αλγόριθμους γραμμένους σε γλώσσα C.Η σπονδυλωτή δομή (κάθε αλγόριθμος τρέχει σαν ξεχωριστό πρόγραμμα το οποίο μόλις ολοκληρώσει τους υπολογισμούς του επιστρέφει τον έλεγχο στο κυρίως menu), επιτρέπει την συστηματική βελτίωση και επέκταση. Προσφέρει "κέλυφος" προγραμματισμού έτσι ώστε να είναι δυνατή η προσαρμογή του σε διάφορες εφαρμογές Σεμινάριο Φυσικής 2008

ΚΥΡΙΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Πέντε είναι τα κύρια υποπρογράμματα του συστήματος των οποίων οι λειτουργίες αναφέρονται περιληπτικά πιο κάτω: Διαχείριση εικόνων (Image Data Management) Παρουσίαση εικόνας (Image Display) Μετασχηματισμοί εικόνων  (Image Transformation) Ποσοτικές μετρήσεις εικόνων (Quantitative Image Mensuration) Βοηθητικά Εργαλεία Οι δυνατότητες του προγράμματος παρουσιάζονται με τα παρακάτω παραδείγματα: Σεμινάριο Φυσικής 2008

Ένα μικρό δείγμα εικόνων - τομών όπως έρχονται από MRI Σεμινάριο Φυσικής 2008

Τομές κυττάρου από συνεστιακό μικροσκόπιο Τομές κυττάρου  από συνεστιακό μικροσκόπιο Σεμινάριο Φυσικής 2008

Η τρισδιάστατη απεικόνιση       Η τρισδιάστατη απεικόνιση Σεμινάριο Φυσικής 2008

Είδη συνεστιακών μικροσκοπίων 3 τύποι εμπορικά διαθέσιμοι CLSM-Confocal laser scanning microscopes spinning-disk ( Nipkow disk ) Programmable Array Microscopes (PAM) Σεμινάριο Φυσικής 2008

CLSM CLSM είναι ευρύτατα διαδεδομένο σε πολλές βιολογικές επιστήμες, από την κυτταρική βιολογία και τη γενετική στην μικροβιολογία και την αναπτυξιακή βιολογία. Κλινικά χρησιμοποιείται κατά την αξιολόγηση των διαφόρων ασθενειών στα μάτια και είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για την απεικόνιση, ποιοτική ανάλυση και ποσοτικοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς Χρησιμοποιείται επίσης και ως μηχανισμός ανάκτησης δεδομένων σε ορισμένα 3D οπτικά συστήματα αποθήκευσης δεδομένων και βοήθησε τον προσδιορισμό της ηλικίας του Magdalen πάπυρου. Σεμινάριο Φυσικής 2008

Nipknow disk Είναι μια μηχανική γεωμετρική συσκευή σάρωσης εικόνας που εφευρέθηκε από τον Paul Nipkow Gottlieb. Ήταν μια βασική συνιστώσα στη εφεύρεση της τηλεόρασης το 1920. Σεμινάριο Φυσικής 2008

Μειονεκτήματα Χαμηλή ποιότητα εικόνας λόγο αυξημένου οπτικού θορύβου Μη γραμμική γεωμετρία στις σαρωμένες εικόνες και μικρό μέγεθος Σεμινάριο Φυσικής 2008

Πόσο μεγάλο είναι? Σεμινάριο Φυσικής 2008

Ποιος το ανακάλυψε? Σεμινάριο Φυσικής 2008

Σεμινάριο Φυσικής 2008

Σεμινάριο Φυσικής 2008

References Thomas Schmit-Physics of fluorence microscopy Science illustrated Wikidedia.com "Confocal Microscopy", D Semwogerere & ER Weeks, published in the Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Taylor & Francis (2005). "Confocal microscopy of colloids", V Prasad, D Semwogerere, ER Weeks, J. Phys.: Cond. Mat. 19, 113102 (2007) "Video Microscopy," Shinya Inoue and Kenneth R. Spring, 2nd ed., Plenum Press, 1997. "Handbook of biological confocal microscopy," edited by James B. Pawley, 2nd ed., Plenum Press, 1995. www.confocal-microscopy.org/ - 10k – www.gonda.ucla.edu/bri_core/confocal.htm Cell Biological Applications of Confocal Microscopy, Second Edition (Methods in Cell Biology) (Methods in Cell Biology, 70) Three-Dimensional Confocal Microscopy: Volume Investigation of Biological Specimens: Volume Investigation of Biological Specimens (Cell Biology) Σεμινάριο Φυσικής 2008