ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ΄ Τάξη Λυκείου Θετικής Κατεύθυνσης Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων (εύκολα-απλά και γρήγορα) 2ο ΕΚΦΕ ΗΡΑΚΛΕΙΟΥ 2010-2011 Επιμέλεια: Κωτίτσας Αριστοτέλης

Παρακάτω παρουσιάζεται το πείραμα «Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων» σε πολύ πιο απλοποιημένη μορφή από ότι στο σχολικό οδηγό Χρειαζόμαστε διάλυμα κιτρικού νατρίου - NaCl και αντί για κρεμμύδι ελαφρά συμπυκνωμένο χυμό ντομάτας. Δε θα χρειαστούμε μπλέντερ, υδατόλουτρο, τριμμένο πάγο, διάλυμα ενζύμου

Όργανα και υλικά ελαφρά συμπυκνωμένος χυμός ντομάτας ζυγός ακριβείας τρία ποτήρια ζέσεως 250 ml ένα κουτάλι σούπας ή πιπέτα ή σύριγγα των 10ml ένα κουταλάκι του γλυκού γυάλινος δοκιμαστικός σωλήνας γυάλινη ράβδος ανάδευσης ένα χωνί φίλτρο του καφέ στήριγμα δοκιμαστικών σωλήνων υγρό πιάτων, ή σαμπουάν 10 ml 2,2 g μαγειρικό αλάτι 11 g κιτρικό νάτριο αποσταγμένο νερό 250 ml αιθανόλη 6 ml, παγωμένη (-20 °C) (μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε και μπλε οινόπνευμα)

Υλικά και όργανα κιτρικό νάτριο γυάλινη ράβδος ανάδευσης φίλτρο του καφέ δοκιμαστικός σωλήνας μεγάλο χωνί υγρό πιάτων αποσταγμένο νερό 250 ml αιθανόλη 6 ml κουτάλι σούπας κουταλάκι του γλυκού ελαφρά συμπυκνωμένος χυμός ντομάτας μαγειρικό αλάτι κιτρικό νάτριο ζυγός ακριβείας τρία ποτήρια ζέσεως 250 ml

Παρασκευή διαλύματος Κιτρικού Νατρίου - NaCl Κιτρικό Νάτριο NaCl Ζυγίζουμε 2,2 g μαγειρικό αλάτι και 11 g κιτρικό νάτριο. Τα τοποθετούμε σ' ένα ποτήρι ζέσεως και συμπληρώνουμε με αποσταγμένο νερό μέχρι όγκου 250 ml, ανακατεύοντας συνεχώς

Σ΄ ένα ποτήρι ζέσεως των 250 ml βάζουμε 20 ml, (δυο κουταλιές της σούπας), από το διάλυμα Κιτρικού Νατρίου - NaCl και 2,5 ml, (μισό κουταλάκι του γλυκού), απορρυπαντικό πιάτων ή σαμπουάν και αναδεύουμε ελαφρά. Προσθέτουμε περίπου 40 - 50 ml από τον ελαφρά συμπυκνωμένο χυμό ντομάτας αναδεύοντας σιγά - σιγά για ένα περίπου λεπτό.

Τοποθετούμε το φίλτρο του καφέ στο χωνί και φιλτράρουμε το μείγμα. Συλλέγουμε το διήθημα στο δεύτερο ποτήρι ζέσεως.

Από το διήθημα παίρνουμε περίπου 10 ml (δυο δάκτυλα), και τα τοποθετούμε στο δοκιμαστικό σωλήνα Προσθέτουμε με προσοχή, σχεδόν ίση ποσότητα παγωμένης αιθανόλης (-20 °C), ώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα επάνω από το διήθημα μας.

DNA Τοποθετούμε τον δοκιμαστικό σωλήνα στο στήριγμα και περιμένουμε 2-3 λεπτά. Τα νουκλεϊκά οξέα συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής διαλύματος/αιθανόλης και «ανεβαίνουν». Οι φυσαλίδες οφείλονται στον αέρα που ελευθερώνεται καθώς ζεσταίνεται η αλκοόλη

Απομόνωση DNA από το βλεννογόνο του στόματος Από το διάλυμα Κιτρικού Νατρίου - NaCl παίρνουμε 10ml (ένα κουτάλι της σούπας), προσθέτουμε λίγες σταγόνες απορρυπαντικού και το βάζουμε σε ένα μικρό δοκιμαστικό σωλήνα σε ένα πλαστικό κύπελλο βάζουμε 10 ml εμφιαλωμένο νερό και το στριφογυρίζουμε ελαφρά στο στόμα για 30 δευτερόλεπτα. φτύνουμε το νερό πίσω στο κύπελλο και ρίχνουμε 10ml από το περιεχόμενο στο δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το διάλυμα Κιτρικού Νατρίου - NaCl -απορρυπαντικού και ανακινούμε ελαφρά

Απομόνωση DNA από το βλεννογόνο του στόματος Στο δοκιμαστικό σωλήνα επιστοιβάζουμε, με προσοχή, σχεδόν ίση ποσότητα παγωμένης αιθανόλης (-20 °C), ώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα επάνω από το διήθημα μας. Μετά από 2-3 λεπτά παρατηρούμε τα νουκλεϊκά οξέα που συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής διαλύματος/αιθανόλης DNA

πυρήνας Τι συμβαίνει εδώ; πλασματική μεμβράνη κύτταρο ντομάτας Το DNA περιβάλλεται από τον πυρηνικό φάκελο, ο οποίος περιβάλλεται από την πλασματική μεμβράνη του κυττάρου. Χρησιμοποιώντας το απορρυπαντικό σπάζουμε τις μεμβράνες και απελευθερώνουμε το DNA.

απορρυπαντικό + φωσφολιπίδια Το μόριο των απορρυπαντικών και των φωσφολιπιδίων αποτελείται από μια υδρόφιλη κεφαλή και μια υδρόφοβη ουρά. Τα μόρια και των δύο, όταν βρεθούν σε υδάτινο περιβάλλον, οργανώνονται σε φυσαλίδες με τις κεφαλές προς τα έξω (σε επαφή με το νερό) και τις ουρές προς το εσωτερικό (μακριά από το νερό). Επειδή το απορρυπαντικό έχει παρόμοια δομή με τα φωσφολιπίδια, όταν έρχονται σε επαφή τα μόρια τους, δημιουργούν φυσαλίδες απορρυπαντικού-φωσφολιπιδίων φωσφολιπίδια απορρυπαντικό απορρυπαντικό + φωσφολιπίδια

τη θραύση των μεμβρανών και την απελευθέρωση του DNA Ανάμεσα στη διπλοστοιβάδα των φωσφολιπιδίων των μεμβρανών, παρεμβάλλονται μόρια πρωτεϊνών. Το απορρυπαντικό συλλαμβάνει τα φωσφολιπίδια και τις πρωτεΐνες με τελικό αποτέλεσμα τη θραύση των μεμβρανών και την απελευθέρωση του DNA απορρυπαντικό απορρυπαντικό+ φωσφολιπίδια & πρωτεΐνες πλασματική μεμβράνη

πρωτεΐνες Προαιρετικά στο διήθημα ρίχνουμε λίγες σταγόνες υγρό φακών επαφής που περιέχει ένζυμα που διασπούν τις πρωτεΐνες (ιστόνες) με τις οποίες πακετάρεται το DNA. Το κιτρικό νάτριο καταστρέφει τις νουκλεάσες που φυσιολογικά υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα Τα Na+ του NaCl εξουδετερώνουν τα ιόντα του φωσφορικού οξέως του DNA και έτσι αυτό συμπυκνώνεται και γίνεται ορατό.

Οι υδρόφοβες αζωτούχες βάσεις των νουκλεϊκών οξέων έλκονται από το υδρόφοβο τμήμα της αλκοόλης και συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής διαλύματος / αιθανόλης. Επειδή το DNA είναι αδιάλυτο στην αλκοόλη γίνεται ορατό ως λευκά συσσωματώματα Καλή επιτυχία

Kάντε κλικ πάνω στην ιστοσελίδα για να μεταφερθείτε σε ένα εικονικό εργαστήριο απομόνωσης ανθρώπινου DNA. (Απαραίτητη η σύνδεση στο διαδίκτυο) http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/