Polymer-virus core-shell structures prepared via co-assembly and template synthesis methods SCIENCE CHINA Chemistry January 2010 Vol.53 No.1: 71–77 LI Tao, NIU ZhongWei, SUTHIWANGCHAROEN Nisaraporn, LI Rui,PREVELIGE Peter E. Jr & WANG Qian

Επεξήγηση για το τι θα δούμε: Φτιάχνουμε δομές  πολυμερές-virus (BNPs- Polymer) με δύο μεθόδους (ταυτόχρονη συναρμολόγηση και μέθοδος σύνθεσης μήτρας ή βάσης). Έχουμε λοιπόν δομές που έχουν ένα σταθερό κομμάτι, το πολυμερές (συχνά το PS) όπου μπορούμε να του προσθέσουμε και χρωστική ουσία, και ένα κομμάτι ιού. (βιοσυμβατά, ο λόγος του ιικού κομματιού μπορει να είναι η τοποθέτηση του σε ανθρώπινο οργανισμό για παράδειγμα, χωρίς να το αποβάλλει ο οργανισμός). Η χρησιμότητα: Αυτές οι δύο μέθοδοι μπορεί να ανοίξουν ένα νέο δρόμο για την δημιουργία νέων λειτουργικών υλικών για πιθανές εφαρμογές στον τομέα της βιοϊατρικής. Για την Ανάλυση και τον χαρακτηρισμό θα χρησιμοποιήσουμε γνωστές τεχνικές: Ανάλυση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο TEM (2D, ηλεκτρονική πυκνότητα), SEM 3D, UV-Vis μελέτες απορρόφησης με φασματόμετρο (υπεριώδης ακτινοβολία)

Bionanoparticles (BNPs) Αποτελούνται από ιούς, ιοειδή συγκροτήματα Έχουν καλά ελεγχόμενη χημεία Φτιάχνουν καθορισμένες σταθερές δομές πυρήνα-κελύφους δηλαδή από μέσα είναι το πολυμερές σαν πυρήνας και από έξω το ΒΝP σαν φλοιός Υπάρχουν δύο σημαντικά πλεονεκτήματα της χρήσης των BNPs. Πρώτον, μια ποικιλία μορίων συμπεριλαμβανομένων φθοροφόρων, πεπτιδιων, υδατανθράκων, πολυμερών, και μεγαλύτερων πρωτεϊνών, μπορούν να παρουσιαστούν σε καθορισμένο περιβάλλον με έλεγχο της απόστασης μέσω συμβατικής bioconjugate χημείας και μερικών νεοεξελιγμένων αντιδράσεων. Δεύτερον, η σαφώς καθορισμένη δομή των BNPs εξασφαλίζει την έλλειψη πολυδιασπαρσιμότητας της μορφολογίας και του μεγέθους

Δύο μέθοδοι για την δημιουργία των δομών αυτών: Μέθοδος ταυτόχρονης συναρμολόγησης (σύστημα 1) Μέθοδος σύνθεσης μήτρας (σύστημα 2,3) Οι δύο αυτοί μέθοδοι χωρίζονται σε τρία συστήματα: 1) Πολυμερές-BNPs με δομή που μοιάζει με βατόμουρο 2) Σφαίρες PS καλυμμένες με ελεύθερες αμίνες και BNPs με δομή πυρήνα-κελύφους 3) Μέθοδος στρώμα με στρώμα (LBL) όπου θετικά φορτισμένα PS χρησιμοποιούνται ως μήτρα και τα αρνητικά φορτισμένα (λόγω των αμινοξέων) BNPs καλύπτουν την επιφάνεια τους για να σχηματισουν δομές πυρήνα-κελύφους.

Ποιο ειδικά τώρα να δούμε τι γίνεται και πειραματικά σε διάφορες περιπτώσεις: Μία τυπική διαδικασία για τη σύνθεση BNPs-πολυμερούς Ένα διάλυμα από P4VP (πολυμερές) σε DMF (διαλύτης) προστέθηκε αργά μέσα σε διάλυμα με CPMV (ιός) σε καθαρό νερό με συνεχή ανάδευση. Στη συνέχεια τα δείγματα είχαν τη δυνατότητα να επωάστουν σε θερμοκρασία δωματίου με συνεχή ανάδευση για 30 λεπτά. Μετά το δείγμα καθαρίστηκε από τυχόν οργανικούς διαλύτες. Έτσι πήραμε: CPMV-P4VP. Μια τυπική διαδικασία για να συνθέσουμε (PS)-BNPs δομές με χρήση σφαιρών PS αλλά επίσης και ύπαρξης χρωστικής στην τελική δομή Τροποποιημένος CPMV (ιός το ΒΝPs) με ροδαμίνη (χρωστική)  CPMV-Rh σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού αναμεμειγμένα με PS σφαιρίδια ολονύκτια. Μετά την επίστρωση του CPMV-Rh στην επιφάνεια των κόκκων πολυστερίνης, τα σύνθετα μόρια είχαν έντονο κόκκινο χρώμα κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού (σχήμα 5). Μια ανησυχία είναι αν οι CPMVs βρίσκονται μόνο στην επιφάνεια του CPMV-PS, η οποία μπορεί να απαντηθεί με μικροσκοπία. Το φθορίζων δαχτυλίδι εμφανίζεται στο (ένθετο) του σχήματος 5 (ε) και δείχνει ότι ιικά σωματίδια ήταν μόνο στην επιφάνεια του χαντρών PS.

LBL συναρμολόγηση BNPs επάνω σε PS μικροσφαιρίδια PS σφαίρες συντάχθηκαν από πολυμερισμό γαλακτώματος. Προκειμένου να φτιαχτούν PS σφαίρες με αρνητικά φορτισμένες επιφάνειες, ήταν βυθισμένες σε μια μεγάλη ποσότητα πυκνού θειικού οξέως και αναδεύονταν. Ένας θετικά φορτισμένος πολυηλεκτρολύτης προστέθηκε στη συνέχεια σε διάλυμα με αρνητικά φορτισμένες PS σφαίρες. Μετά από 20 λεπτά, οι PS σφαίρες είχαν θετικά φορτισμένες επιφάνειες. Στη συνέχεια, ο τροποποιημένος CPMV με φλουροσύνη (χρωστική, πράσινο χρώμα) (FL-CPMV) που είναι αρνητικά φορτισμένος (σε pH 7,8, διότι το ισοηλεκτρικό του σημείο (pI) είναι περίπου στο 5,5) τοποθετείται μέσα σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα μαζί με το PS για να δώσουν PS σφαίρες καλυμμένες με FL-CPMV.

Το σχήμα 7 (α) δείχνει τις SEM εικόνες των PS-CPMV-FL σωματιδίων /εικόνα με μικροσκοπια φθορισμού των PS-CPMV-FL Σχήμα 7 (β)

Σχηματισμός BNPs-πολυμερών δομής πυρήνα-κελύφους με την μέθοδο της ταυτόχρονης-συναρμολόγησης και επίσης θα δούμε δομές των BNPs Η κινητήρια δύναμη της μεθόδου της ταυτόχρονης- συναρμολόγησης θα μπορούσε να έχει αποδοθεί στους μη ομοιοπολικούς δεσμούς, ηλεκτροστατικούς, υδροφοβικότητα, δεσμούς υδρογόνου. Το P4VP θα έκανε δομές με BNPs διαφόρων σχημάτων όπως σφαιρικό CPMV ή ραβδοτοTMV όπως φαίνεται στο Σχέδιο 1. Το CPMV, ένα σχετικά απλό εικοσαεδρικό σωματίδιο (σχήμα 1 (α)), αποτελείται από 60 πανομοιότυπα αντίγραφα δύο ασύμετρων μονάδων πρωτεϊνών (τη μικρή υπομονάδα και τη μεγάλη υπομονάδα). Οι δύο αυτές υπομονάδες είναι διατεταγμένες γύρω από ένα μονόκλωνο ιικό γονιδιωματικο RNA για να σχηματίσουν ένα σφαιρικό σωματίδιο (Σχήμα 1 (β)). Τα CPMV σαν υλικά έχουν δείξει δυνητικές εφαρμογές στην στοχοθετημένη χορήγηση φαρμάκων.

CPMV-P4VP δομής πυρήνα-κελύφους με ΤΕΜ 2D (σχήμα 1(c)) και FESEM 3D (σχήμα 1(d)).

Ένα άλλο σφαιρικό BNP, ο P22 βακτηριοφάγος, συναρμολογείται από 420 αντίγραφα της πρωτεϊνικής υπομονάδας με τη βοήθεια περίπου 300 αντίγραφων του ικριώματος πρωτεϊνών (εικόνα2). Τα συγκροτήματα P22-P4VP πυρήνα-κελύφους μπορούν να προετοιμαστούν με τη μέθοδο της ταυτόχρονης-συναρμολόγησης. TEM (Σχήμα 2 (γ)) και SEM (Σχήμα 2 (δ)).

Παρόμοιες μέθοδοι μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τη συναρμολόγηση ραβδοτών BNPs. TMV, (ραβδοειδούς virus), αποτελείται από 2130 όμοιες πρωτεινικές υπομονάδες, συναρμολογήται σε ένα ελικοειδές μοτίβο γύρω από το γονιδιακό single stand RNA (Σχήμα 3 (α)), εικόνα TEM (Σχήμα 3 (β)). TEM (Σχήμα 3 (γ)) και FESEM (Σχήμα 3 (δ)): για TMV-P4VP δομής πυρήνα- κελύφους.

Έχει διαπιστωθεί ότι το P4VP σε διάφορα μοριακά βάρη μπορεί να οδηγήσει σε δομές πυρήνα-κελύφους μέσω της διαδικασίας της συν- συναρμολόγησης με BNPs. Τα 4 (α) και (β) δείχνουν εικόνες TEM και SEM του CPMV-P4VP χρησιμοποιώντας μεγάλου μοριακού βάρους P4VP ως πρώτες ύλες. Η ίδια στρατηγική μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί στην προετοιμασία άλλων πολυμερών όπως CPMV-P2VP και CPMV-PCL-b-P2VP δομής πυρήνα-κελύφους (Σχήμα 4 (γ) και 4 (δ)).

Μερικές φωτογραφίες με zoom in, zoom out: Το σχήμα 6 (α) που ακολουθεί δείχνει τυπικές SEM εικόνες των CPMV-PS σωματιδίων. Δεδομένου ότι η μεγέθυνση του SEM αυξήθηκε, παρατηρήθηκε ότι τα CPMV σωματίδια σχηματίζουν αυστηρές δομές μεγάλων αποστάσεων στην επιφάνεια των χαντρών PS, όπως φαίνεται στον Σχήμα 6 (δ).

σφαιρικό Ρ22 (Σχήμα 6 (β),(ε)) ραβδοτό TMV (Σχήμα 6 (γ), (στ))

Συμπεράσματα και προοπτικές Με λίγα λόγια, έχουμε αποδείξει δύο διαφορετικές προσεγγίσεις (i) την ταυτόχρονη-συναρμολόγηση και (ii) την σύνθεση-μήτρας για την κατασκευή πολυμερών-BNPs πυρήνα-κελύφους δομών, ενώ τα BNPs εξακολουθούν να διατηρούν την αρχική δομική λειτουργία τους και τις βιολογικές λειτουργίες. Ο επόμενος στόχος θα είναι η εφαρμογή του παρόντος βιομιμητικού σωματίδιου σε βιολογικές εφαρμογές, όπως την παράδοση των φαρμάκων και των πρωτεϊνών.