Polymerase Chain Reaction (PCR) Διδακτικά σχήματα 3η Εργασία – θέμα 2ο Μπακολίτσας Κώστας

Polymerase Chain Reaction Πολυμεράση: DNA πολυμεράση Η DNA πολυμεράση αντιγράφει το DNA Πρίν ένα κύτταρο διαιρεθεί, το DNA του πρέπει να αντιγραφεί Αλυσιδωτή αντίδραση: Το προϊόν της αντίδρασης χρησιμοποιείται για να ενισχύσει την ίδια την αντίδραση Καταλήγει σε γρήγορη αύξηση των προϊόντων

Polymerase Chain Reaction (PCR) Η PCR επιτελεί την χημική αντιγραφή του DNA in vitro Πολυάριθμες PCR εφαρμογές κάνουν χρήση αυτής της διαδικασίας σε πολλά εργαστήρια βιολογίας Καταλαβαίνοντας τις ιδιότητες των DNA πολυμερασών συμβάλουμε στην κατανόηση της PCR

Ανακάλυψη Η PCR ανακαλύφθηκε από τον Kary Mullis Σε μια μακροχρόνια οδήγηση μοτοσικλέτας Διανοητικά απεικόνισε τη διαδικασία Βραβείο Nobel στη Χημεία 1993

DNA πολυμεράση Αντιγράφει DNA Απαραίτητη για την αναπαραγωγή νέων κυττάρων Περισσότερες από μία DNA πολυμεράσες προερχόμενες από διαφορετικούς οργανισμούς

Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Δεν μπορεί να συναρμολογήσει έναν νέο κλώνο από τα συστατικά του Λέγεται πρότυπο DNA Μπορεί μόνο να επεκτείνει προϋπάρχοντα τμήματα DNA που Λέγονται εκκινητές 5’ 3’ 3’ 5’

Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Η DNA πολυμεράση χρειάζεται Mg++ σαν συμπαράγοντα Κάθε DNA πολυμεράση δουλεύει καλύτερα κάτω βέλτιστη θερμοκρασία, pH και συγκέντρωση άλατος Το PCR ρυθμιστικό διάλυμα εξασφαλίζει βέλτιστο pH και κατάσταση αλατότητας

Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Ο ένας κλώνος είναι 5’  3’ Ο συμπληρωματικός του είναι 3’  5’ Η DNA πολυμεράση πάντα κινείται με κατεύθυνση (από 5’  3’) 5’ 3’ 3’ 5’

Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Η DNA πολυμεράση ενσωματώνει τα 4 νουκλεοτίδια (A, T, G, C) στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα Τα dNTP ακολουθούν τον πρότυπο κανόνα ένωσης των βάσεων dCTP dTTP dGTP dATP 5’ 3’ 3’ 5’

Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Οι πρόσφατα παραγόμενοι DNA κλώνοι λειτουργούν σαν πρότυπο DNA για τον επόμενο κύκλο Η PCR είναι πολύ ευαίσθητη Ευρεία χρήση

Προετοιμάζοντας μιά PCR αντίδραση Προσθέτουμε πρότυπο DNA εκκινητές Προσθέτουμε dNTPs Προσθέτουμε DNA πολυμεράση dCTP dTTP dGTP dATP 5’ 3’ 3’ 5’

Η σχεδίαση του εκκινητή μια πολύ επίπονη διαδικασία, με την οποία παράγεται ένα προϊόν : Η GC-περιεκτικότητα πρέπει να είναι μεταξύ 40-60%. Η υπολογισμένη Tm και για τους δύο χρησιμοποιούμενους εκκινητές στην αντίδραση δεν πρέπει να διαφέρει περισσότερο από 5°C, και η Tm από το προϊόν ενίσχυσης δεν πρέπει να διαφέρει από τους primers περισσότερο από 10°C (Στην πράξη μπορεί να μην είναι πάντα αληθινή). Θερμοκρασία αναδιάταξης συνήθως είναι 5°C κάτω από την υπολογισμένη χαμηλότερη Tm. Εντούτοις, πρέπει να επιλεχτεί εμπειρικά για τις ιδιαίτερες συνθήκες. Πρέπει να αποφευχθεί εσωτερική αυτοσυμπληρωματική φουρκέτα από >4 και από >8 διμερή. Η σχεδίαση του 3'άκρου του εκκινητή είναι κρίσιμο στην επιτυχία της PCR από εκκινητή που επιμηκύνεται από το 3' άκρο. Το 3΄ άκρο δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικό με περισσότερες από 3-4 βάσεις σε οποιαδήποτε περιοχή του άλλου εκκινητή (ή ακόμα και του ίδιου εκκινητή) που χρησιμοποιείται στην αντίδραση και πρέπει να παρέχει σωστό ταίριασμα βάσεων στο πρότυπο.

Υπάρχουν προγράμματα υπολογιστών για να βοηθήσουν στον σχεδιασμό των εκκινητών

Αλγόριθμος για την σχεδίαση εκκινητή Εισαγωγή του μήκους των εκκινητών Εισαγωγή DNA αλληλουχίας Εισαγωγή της έναρξης και του τερματισμού της κεντρικής περιοχής Tm: 55-65oC N Y GC περιεκτικότητα 45-55% Αποκλεισμένοι εκκινητές N Y Φούρκες και αυτό-διμερισμός Y N Λίστα από αποδεκτούς εκκινητές N διασταυρούμενος διμερισμός Y

Taq DNA πολυμεράση Προέρχεται από το Thermus aquaticus

Thermus aquaticus Tο βακτήριοThermus aquaticus ανακαλύφθηκε αρχικά σε διάφορες θερμοπηγές στην περιοχή Great Fountain του Lower Geyser Basin στο Yellowstone National Park

Θερμοανθεκτικές DNA πολυμεράσες Exo- Pfu DNA Polymerase Herculase Enhanced DNA Polymerase Pfu DNA Polymerases PfuTurbo DNA Polymerase SureStart Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase Taq2000 DNA Polymerase TaqPlus Long PCR System TaqPlus Precision PCR System YieldAce DNA Polymerase

Θερμική ανακύκλωση Η PCR μηχανή ελέγχει τις θερμοκρασίες Αποδιάταξη Επαναδιάταξη Επέκταση

Αποδιάταξη Η θέρμανση χωρίζει το δίκλωνο DNA Αργή ψύξη επαναδιαττάσει τους δύο κλώνους Επαναδιάταξη Heat Cool

Επαναδιάταξη Οι δύο εκκινητές εφαρμόζονται σε μοριακή περίσσεια Σύνδεση των συμπληρωματικών περιοχών Καθώς το DNA ψύχεται, παρεμβάλλονται μεταξύ των δύο προτύπων κλώνων Η βέλτιστη θερμοκρασία ποικίλει ανάλογα με το μήκος του εκκινητή κ.λ.π. Τυπική θερμοκρασία από 40 έως 60οC

Επέκταση Η DNA πολυμεράση αντιγράφει το DNA Βέλτιστη θερμοκρασία 72οC

PCR Ενίσχυση Εκθετική ενίσχυση του προτύπου DNA

 Polymerase Chain Reaction DNA - αλληλουχία σε ένα πλασμίδιο Η κοπή περιορισμού του πλασμιδίου απελευθερώνει τις αλληλουχίες του DNA που μας ενδιαφέρουν Polymerase Chain Reaction Συνθέτει μόνο το γονίδιο που μας ενδιαφέρει χρήση Forward και Reverse εκκινητών (ειδικά μικρά κομμάτια DNA) με τη βοήθεια του ενζύμου πολυμεράση. Όλοι οι κύκλοι ακολουθούν ένα αυστηρό χρονοδιάγραμμα θερμοκρασιών. πρώτος cDNA κλώνος Forward εκκινητής Reverse εκκινητής δεύτερος cDNA κλώνος Το γονίδιο που μας ενδιαφέρει

PCR 5’ 3’ 5’ 3’ Mg++ Mg++ Mg++

Τυπικό PCR μίγμα Σε έναν λεπτό σωλήνα Eppendorf συγκεντρώνουμε τα ακόλουθα DNA πρότυπο, που περιέχει το τμήμα του DNA που ενισχύεται. Δύο εκκινητές, (βιοτινυλιωμένοι) έναν forward και έναν reverse, οι όποιοι καθορίζουν την αρχή και το τέλος της περιοχής που θα ενισχυθεί. Taq πολυμεράση (ή άλλη θερμοανθεκτική πολυμεράση), η DNA πολυμεράση που αντιγράφει την περιοχή που θα ενισχυθεί. Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια , (dNTPs) από τα οποία η DNA πολυμεράση χτίζει το νέο DNA (2Mm). Ρυθμιστικό διάλυμα, που παρέχει ένα κατάλληλο χημικό περιβάλλον για την DNA πολυμεράση [(x10) 100mM Tris-HCl, Ph 8.3 – 500mM KCl – 15mM MgCl (προαιρετικά)]. Mg+2 κατιόν μαγνησίου (σε μορφή MgCl2 25 mM ,διαλυτά σύμπλοκα με τα dNTPs για εύκολη ενσωμάτωσή τους στην αλυσίδα του DNA ) ή ιόντα μαγγάνιου. Μονοσθενή κατιόντα καλίου Αποστειρωμένο απιονισμένο νερό. Πάγο. Αγαρόζη. 6X διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων. Διάλυμα βρωμιούχου εθιδίου (10mg/ml).

PCR βελτιστοποίηση Βελτιστοποίηση ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών. Υπόστρωµα - Υψηλή οµοιογένεια - Χαµηλός αυτοφθορισµός. Ολιγονουκλεοτίδιο ανίχνευσης. Καθαρότητα→Ευαισθησία Μήκος Χηµεία σύνδεσης → Σταθερότητα κατά τα επόµενα στάδια υβριδισµού και έκπλυσης (θερµοκρασίες 4°C έως 95°C, τιµές pH 1 έως 10, ιονική ισχύ σε NaCl από 0 έως 4 M). Ικανή συγκέντρωση στην επιφάνεια ώστε να έχουµε υψηλό σήµα χωρίς στερεοχηµική παρεµπόδιση. Βελτιστοποίηση υβριδισµού ολιγονουκλεοτιδίων στόχων. Επαρκής ενσωµάτωση µορίων σηµατοδότησης (ιχνηθετών) κατά την PCR. Σύσταση του διαλύµατος υβριδισµού: ιονική ισχύς, αποδιατακτικοί παράγοντες, κλπ. Θερµοκρασία υβριδισµού Tm : θερµοκρασία στην οποία τα πλήρως συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια βρίσκονται συµπλεγµένα κατά 50% Td : θερµοκρασία σε µια συγκεκριµένη συγκέντρωση άλατος και ολιγονουκλεοτιδίων στην οποία το 50% ενός ολιγονουκλεοτιδίου είναι συµπλεγµένο µε το πλήρως συµπληρωµατικό του Td= 2°C (A+T) + 4°C(G+C). Η θερµοκρασία υβριδισµού και το µήκος του ακινητοποιηµένου ολιγονουκλεοτίδιου είναι καθοριστικοί παράγοντες της ειδικότητας του υβριδισµού. Εκπλύση µε διαλύµατα µειούµενης ιονικής ισχύος. Μείωση σήµατος φθορισµού ↔Αύξησηειδικότητας.

Εφαρμογές Γενετική δακτυλοσκοπία Δοκιμή πατρότητας Ανίχνευση των κληρονομικών ασθενειών Κλωνοποίηση γονιδίων Μεταλλαξιγένεση Ανάλυση αρχαίου DNA Γενοτύπηση συγκεκριμένων μεταλλαγών Σύγκριση της έκφρασης γονιδίων

Πρακτικές τροποποιήσεις στη pcr τεχνική RT-PCR Nested PCR Intersequence specific (ISSR) PCR FISSR-PCR Ligation-mediated PCR Inverse PCR Vectorette-PCR Assembly PCR Asymmetric PCR-Late PCR Quantitative PCR Quantitative real-time PCR Taqman PCR Sybr Green PCR Touchdown PCR Hot-start PCR Colony PCR RACE-PCR Multiplex (Πολυσύνθετη) - PCR Ειδικής μεθυλίωσης PCR In Situ PCR AFLP PCR

Πρόσφατες εξελίξεις στις PCR τεχνικές Helicase-dependent amplification (HDA) TAIL PCR Meta-PCR

Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με χρήση της RT-PCR

RT – Reverse Transcription (Αντίστροφη μεταγραφή) Τι αντιπροσωπεύει ο όρος “RT-PCR”? Περιλαμβάνει 2 διαδικασίες : RT – Reverse Transcription (Αντίστροφη μεταγραφή) Κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος συνθέτουμε μονόκλωνο DNA από RNA πρότυπο PCR – Polymerase chain reaction Με χρήση ειδικών για το γονίδιο εκκινητών ενισχύουμε we amplify a ορισμένα τμήματα του γονιδίου που μας ενδιαφέρουν για να πετύχουμε αρκετή ποσότητα για περεταίρω ανάλυση

DNA και RNA – Ποια είναι η διαφορά! Χρησιμοποιείται από τα κύτταρα για να αποθηκεύει πληροφορίες (χρωμοσώματα) Υλικό της κληρονομικότητας Χρησιμοποιείται στις εγκληματολογικές επιστήμες Χρησιμοποιείται από τους αρχαιολόγους(~ 50.000 χρόνια)

DNA και RNA – Ποια είναι η διαφορά! Χρησιμοποιείται από τα κύτταρα για την προσωρινή έκφραση της πληροφορίας Το προφίλ του κυτταρικού RNA αλλάζει από λεπτό σε λεπτό Αποικοδομείται πολύ εύκολα– και κατά την διαδικασία της απομόνωσης

Το κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας Το DNA αντιγράφει τις πληροφορίες με μια διαδικασία που περιλαμβάνει πολλά ένζυμα UNIDIRECTIONAL Το DNA κωδικεύει για την παραγωγή messenger RNA (mRNA) ή γενικά RNA Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το mRNA επεξεργάζεται (ουσιαστικά με το μάτισμα) και μεταναστεύει από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα Το Messenger RNA μεταφέρει τις γενετικές πληροφορίες στο ριβόσωμα. Τα ριβοσώματα «διαβάζουν" αυτές τις πληροφορίες και τις χρησιμοποιούν για να συνθέσουν πρωτείνες

Πως δουλεύει η μεταγραφή? Το ένζυμο της μεταγραφής συνδέεται στο δίκλωνο DNA, χωρίζει τους κλώνους και DNA φτιάχνει μια θηλιά. Η μεταγραφή αρχίζει και το mRNA επιμηκύνεται Η επιμήκυνση συνεχίζεται μέχρι το τέλος της μεταγραφικής μονάδας

Πως οι ιοί πρόκλησης καρκίνου RNA προκαλούν καρκίνο;;; Η ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφάσης Ιός Δίκλωνο ιϊκό DNA Μονόκλωνο ιϊκό DNA RNA ιός (Ρετροϊός) Δεν περιέχει DNA Πρωτοαναγνωρίστηκε γιατί προκαλούσε διάφορους καρκίνους στα ζώα Καρκινικά κύτταρα έχουν γενετική σταθερότητα Το RNA δεν είναι σταθερό για σταθερή επιμόλυνση Πως οι ιοί πρόκλησης καρκίνου RNA προκαλούν καρκίνο;;;

Είναι το κεντρικό δόγμα μια “ιερή αγελάδα”; Υπάρχει εδώ επιστροφή;;; ?

1970: 1975: Η ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφάσης Δύο διαφορετικές ερευνητικές ομάδες, η μια καθοδηγούμενη από τον Temin και η άλλη από τον David Baltimore, ταυτόχρονα ανακάλυψαν την άγνωστη μέχρι τότε υπεύθυνη για την αντιγραφή από RNA σε DNA πολυμεράση σε καθαρά ιοσώματα μετά από πολλά χρόνια κοπιαστικών εργαστηριακών ερευνών. 1975: Οι Temin και Baltimore πήραν το Βραβείο Nobel στην Φυσιολογία ή την Ιατρική για την ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφάσης

Τι κάνει η αντίστροφη μεταγραφή; copy c c c Η αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιεί ένα μονόκλωνο RNA πρότυπο για να δομήσει δίκλωνο DNA.

Πως μπορεί αυτό να χρησιμοποιηθεί στην έρευνα; μεταγραφή AAAAA mRNA μεταγραφή mRNA AAAAA AAAAA mRNA transcription Αντίστροφη μεταγραφή cDNA ανάλυση Εξαιρετικό εργαλείο για την μελέτη γονιδίων που πραγματικά εκφράζονται σε διάφορους τύπους κυττάρων/ιστών/οργάνων. Καταγραφή αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης κατά την διάρκεια περιβαλλοντικών επιδράσεων

Μόνο το mRNA έχει μια πολύ-αδενυλική ουρά στό 3’ άκρο Ας αρχίσουμε! ολικό RNA RNA απομόνωση ~ 1% mRNA rRNA tRNA Το περισσότερο από το RNA είναι ασήμαντο για μας (tRNA, rRNA) Ο mRNA πληθυσμός αποτελείται από περίπου 3-5000 διαφορετικά είδη Ισχυρή δευτεροταγής δομή– το ένζυμο δεν μπορεί να δουλέψει Μόνο το mRNA έχει μια πολύ-αδενυλική ουρά στό 3’ άκρο AAAAA

2. αναδιάταξη + επιμήκυνση RT αντίδραση – βήμα-βήμα TTTTT TTTTT AAAAA RNase καταστολέας TTTTT TTTTT dATP dCTP dGTP dTTP 65 ºC + πάγος 1. αποδιάταξη AAAAA mRNA RT Αντίστροφη μεταγραφή 2. αναδιάταξη + επιμήκυνση 37 ºC AAAAA mRNA TTTTT cDNA AAAAA 37 ºC AAAAA mRNA cDNA RT TTTTT RT έτοιμη

Τι θα γινόταν με το cDNA μας τώρα? Προβλήματα: Τεράστια ποικιλία από cDNA μόρια (τουκάχιστον 3-5000 διαφορετικά είδη) Μόνο ένα αντίγραφο DNA υπάρχει για κάθε mRNA κλώνο Άφθονα (housekeeping) γονίδια δίνουν το 90% του πληθυσμού του mRNA They mask our gene of interest Λύση: χρειαζόμαστε μία αντίδραση που να μπορεί να ενισχύσει το μικρής αφθονίας γονίδιο ΚΑΙ ειδικά αρκετά μη ενισχυόμενα άλλα cDNAs +++ Επιπλέον χρειαζόμαστε ένα ένζυμο που μπορεί να αντιγράφει το DNA

DNA αντιγραφή σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα Το ένζυμο που κάνει τη δουλειά: DNA-DNA πολυμεράση Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε αυτό σε πρότυπο cDNA;

Πως δουλεύει η DNA-DNA πολυμεράση 5` 3` 5` 3` 5` ολιγομερές Κατασκευή ενός αντίγραφου κλώνου! 5` Pol 3` 5` 3` 1985: Kary B. Mullis - Τι θα συνέβαινε αν αποδιατάσσαμε και συνδέαμε ένα ολίγομερές προς τα πίσω… 5` ολιγομερές 5` 3` Θα φτιάχναμε έναν δεύτερο!! 5` ολιγομερές Pol 5` 3` … και επαναλαμβάνουμε αυτό ξανά και ξανά ; Pol

Polymerase Chain Reaction (PCR) Κύκλος #4 3 κύκλοι – 2 4 κύκλοι – 4 5 κύκλοι – 8 . 10 κύκλοι – 256 20 κύκλοι – 4 194 304 30 κύκλοι – 4 294 967 296 Κύκλος #5

Ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές Πως θα ενισχύσουμε τα γονίδια που μας ενδιαφέρουν από την cDNA “σούπα”; TTTTT AAAAA cDNA TTTTT AAAAA cDNA Ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές TTTTT cDNA AAAAA PCR γονίδιο #2 750 bp 500 bp γονίδιο #1 νοερή εικόνα πηκτής

επαναδιάταξη + επιμήκυνση Η RT–PCR στους εργαστηριακούς πάγκους RT: Πρόσθεση: Ένζυμο dNTPs RNasin 65ºC – 10 min αποδιάταξη 37 ºC – 1 ώρα ολικό RNA + ολιγοdT RT έτοιμη επαναδιάταξη + επιμήκυνση πρότυπο 1-5 ul PCR: ενίσχυση 95ºC – 30 sec 55ºC – 30 sec 72ºC – 1 min 72ºC 10 min 95ºC 3 min αποδιάταξη DNA pol dNTPs εκκινητές Ρυθμιστικό διάλυμα MgCl2 PCR έτοιμη 30 κύκλοι τέλος Ανάλυση σε πηκτή

Εφαρμογές της RT-PCR Κλωνοποίηση γονιδίων (εκφραζόμενοι σχηματισμοί) (όχι γενωμική έκδοση) Καταγραφή του επιπέδου της γονιδιακής έκφρασης σε κάθε ιστό Καταγραφή των αλλαγών στην έκφραση κατά την διάρκεια θεραπευτικής αγωγής Εξελιγμένη RT-PCR: (Η πραγματικού χρόνου) real time PCR Αλληλούχιση σε ολόκληρο το mRNA προφίλ EST (Expressed Sequence Tags) – βάση δεδομένων Μικροσυστοιχίες (DNA chip) Διάγνωση and εύκολη αντιδιαστολλή μεταξύ διαφορετικών τύπων καρκίνου Έγκαιρο εντοπισμό κρυφών ασθενειών κλπ…

Standard PCR ποιοτική Μικρός φόρτος εργασίας υψηλό ρίσκο μόλυνσης εξειδίκευση ανάλογη με το μέγεθος ζώνες μπορεί να είναι προωθημένες (αλληλούχιση/ περιοριστικά ένζυμα)

Standard PCR θερμοκυκλωτήρες PTC-100® Peltier Thermal Cycler MJ Research Thermal Uniformity: ±0.5°C within 30 seconds of arrival at 60°C Ramping Speed: 60: up to 1°C/second, 96: up to 1.4°C/second, 96AgV: up to 2.5°C/second, 16MS: up to 0.5°C/second

Real-Time PCR

Real-Time PCR ποσοτική ειδική (ποικίλει με τη χημεία) Αρκετή δουλειά μειωμένο ρίσκο μόλυνσης Υψηλότερο κόστος αντιδραστηρίων Ποικιλία χημικών αντιδράσεων Sybr Green™ TaqMan™ Scorpion™ Hybridization Probes Simple Probes Molecular Beacons Multiplex ικανότητα σε κάποιες χημικές αντιδράσεις

Πως λειτουργεί η Real-Time PCR

Real-Time PCR δεδομένα

SYBR Green εντοπισμός χρωστικές συνδέονται με το δίκλωνο DNA Ανάλυση καμπύλης τήξης ποιοτική/ ποσοτική Μικρή εξειδίκευση γενικά singleplex

Μοριακός φάρος

Σκορπιός Figure 1. Scorpion probing mechanism. Step 1: initial denaturation of target and Scorpion stem sequence. Step 2: annealing of Scorpion primer to target. Step 3: extension of Scorpion primer produces double-stranded DNA. Step 4: denaturation of double-stranded DNA produced in step 3. This gives a single-stranded target molecule with the Scorpion primer attached. Step 5: on cooling, the Scorpion probe sequence binds to its target in an intramolecular manner. This is favoured over the intermolecular binding of the complementary target strand.

Σύνοψη των δεικτών σχημάτων Το LightTyper σύστημα SNP αναγνώριση των καμπυλών τήξης Σύνοψη των δεικτών σχημάτων Hybδείκτη σχήμα: Διπλού δείκτη σύστημα αξιοποιεί FRET μεταξύ υβριδοποιημένων ιχνηθετημένων δεικτών Απλού δείκτη σχήμα: Απλός φθορίζων ιχνηθετημένος δείκτης. Το σήμα φθορισμού εξαρτάται από την κατάσταση υβριδισμού (Fluorescein)

TaqMan χημεία R Real Time/Quantitative PCR Stepwise representation of the 5’-3’ fork-like structure dependent , polymerization associated nuclease activity of AmpliTaq® DNA Polymerase during one extension phase of PCR. When the probe is intact, the proximity of the reporter dye to the quencher dye results in suppression interest is present, the probe specifically anneals between the forward and reverse primer sites. The 5’-3’ nucleolytic activity of Taq cleaves the probe between the reporter and the quencher dyes only if this probe hybridizes to the target; Taq does not digest free probe. The remainder of the probe is then displaced from the target and polymerization of the strand continues. This process occurs in every cycle of PCR and does not interfere with the exponential accumulation of product. The separationured and is a directly proportional to the target amplification during PCR. Because the probe is in excess, every copy made generates a cleaved probe which has active reporter fluorescence.

Χημεία μοριακού φάρου Real Time/Quantitative PCR 5´/3´ (αναφορέας / αποσβέστης) διπλοϊχνηθετημένα ολιγονουκλεοτίδια μονομόρια stem-loop δομή με απουσία στόχου εσωτερική φουρκέτα φέρουσα τις ομάδες των αναφορέων και των αποσβεστών σε φυσική εγγύτητα FRET προσαρμοστική αλλαγή με υβριδισμό κάθε σημπληρωματικού στόχου (δι-μόρια προσαρμογή) Μοριακός δείκτης ξεδιπλώνονται και υβριδίζουν με την παρουσία του στόχου αναφορέα του οποίου η χρωστική εκπέμπει φθορίζοντα σήματα

Χημεία μοριακού φάρου Real Time/Quantitative PCR Λούπα Ακολουθία από 15 (υψηλό GC%) έως 30 (χαμηλό GC%) βάσεις Ακολουθία υβριδοποιημένη με ακολουθίες του σημπληρωματικού στόχου Ο δείκτης - υβρίδιο στόχος δεν μπορεί να συνυπάρξει με το τον μίσχο - υβρίδιο λόγω της δυσκαμψίας των DNA ελικασών. Εξαιρετικό τέριασμα δείκτη - υβριδίου είναι ενεργητικά πιό σταθερό από τη δομή της λούπας-μίσχου. Μη τέριασμα δείκτη – υβριδίου στόχου είναι ενεργητικά λιγότερο σταθερό από τη δομή του μίσχου-λούπας. εξαιρετική εξειδίκευση Μίσχος 5-7 βάσεις (Tm 55-70°C) 3´και 5´άκρα οδηγούν αναφορέα /αποσβέστη Χρωστική Αναφορέας: Fluo, Fam, Hex, Tet, Rox, Tamra, Cy3, Cy5, .. Αποσβέστης: BHQs, Dabcyl, ...

Επιπλέον Βιβλιογραφία http://www.bookrags.com/sciences/genetics/reverse-transcriptase-gen-04.html vcell.ndsu.nodak.edu/~christjo/vcell/animationSite/transcription/movie.htm http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html http://en.wikipedia.org/wiki/RT-PCR http://www.accessexcellence.org/AB/GG/polymerase.html http://www.accessexcellence.org/AB/BC/Kary_B_Mullis.html http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm http://www.karymullis.com/ http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/PolymeraseChainReaction/ http://www.emblheidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/ flowchart/clo_pcr_strategy/primer_design.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/NAWBIS/Modules/DNA/dna9.html http://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html http://www.alumni.ca/~leema3m/bg/pcr.html http://marvin.ibest.uidaho.edu/~heckendo/CS504/Students/P/waltari.pdf