ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΣΤΟΧΟΙ Η εξοικείωση με τη διαδικασία απομόνωσης του DNA από κύτταρα φυτικού οργανισμού. Η αναγνώριση της χρησιμότητας των ενζύμων. Η διαπίστωση ότι ορισμένα πειράματα μπορούν να πραγματοποιηθούν πολλές φορές με απλά υλικά καθημερινής χρήσης. Εγγλεζάκη Φρίντα (Χημικός)

Aλάτι (κοινό μαγειρικό) (1g) Yγρό πιάτων (10ml) ΥΛΙΚΑ Aκτινίδιο ή μπανάνα Απιονισμένο νερό (100mL) Aλάτι (κοινό μαγειρικό) (1g) Yγρό πιάτων (10ml) Αιθανόλη παγωμένη (95%) (5mL) Πεψίνη (1g/100mL H2O απιονισμένο) ή υγρό φακών επαφής Πάγος** ΟΡΓΑΝΑ Ζυγαριά Blender κουζίνας Ποτήρι ζέσεως (1Χ250mL) Ποτήρι ζέσεως (1Χ500mL)** Ογκομετρική φιάλη (250mL) Ογκομετρικοί κύλινδροι (1Χ100mL και 1Χ10mL) Στατώ με δοκιμαστικό σωλήνα (μεγάλος ~30mL) Ύαλος ωρολογίου Ράβδος ανάδευσης Χωνί διήθησης Διηθητικό χαρτί Σπάτουλα Μαχαίρι Παρασχίδα ξύλου Πεχαμετρικό χαρτί Τρίποδας, πλέγμα, λύχνος, αναπτήρας, θερμόμετρο 0-100 0C** Σημείωση Το διάλυμα της πεψίνης συνιστάται να παρασκευάζεται λίγο πριν την έναρξη της πειραματικής διαδικασίας ή διαφορετικά παρασκευάζεται και φυλάσσεται στο ψυγείο (θερμοκρασία 4 οC) για καλύτερα αποτελέσματα. Η αιθανόλη τοποθετείται στον καταψύκτη του ψυγείου 24 ώρες πριν. **Τα όργανα αυτά χρειάζονται σε περίπτωση που θα επιλέξετε να χρησιμοποιήσετε υδατόλουτρο και πάγο (δείτε την πειραματική διαδικασία).

Πειραματική διαδικασία Σε ογκομετρικό κύλινδρο προσθέτουμε 100mL απιονισμένο νερό και τα ρίχνουμε σε ένα ποτήρι ζέσεως. Ζυγίζουμε 3g αλάτι σε ύαλο ωρολογίου και τα προσθέτουμε στο ποτήρι ζέσεως, αναδεύοντας με τη ράβδο ανάδευσης μέχρι να διαλυθεί πλήρως το αλάτι. Κόβουμε το ακτινίδιο σε μικρά κομμάτια και τα προσθέτουμε στο αλατόνερο. Ρίχνουμε το μίγμα στο blender και ομογενοποιούμε για 5 δευτερόλεπτα.

Προσθέτουμε 5mL απιονισμένο νερό στον ογκομετρικό κύλινδρο των 10mL και στη συνέχεια συμπληρώνουμε με 5mL υγρό πιάτων. Μεταφέρουμε το ομογενοποιημένο μίγμα στο ποτήρι ζέσεως και προσθέτουμε το διάλυμα του υγρού πιάτων, αναδεύοντας ήπια με τη ράβδο και προσέχοντας να μην δημιουργηθούν φυσαλίδες. Στη συνέχεια φιλτράρουμε το ομογενοποιημένο μίγμα περνώντας το από το χωνί (ή σουρωτήρι) με το φίλτρο και συλλέγουμε το υγρό σε ποτήρι ζέσεως. Τοποθετούμε το τελικό μίγμα σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 60 0C για 15 λεπτά και στη συνέχεια σε πάγο για 10 λεπτά (Το στάδιο αυτό μπορεί να παραληφθεί χωρίς να επηρεασθεί η απομόνωση του DNA)

Μεταφέρουμε περίπου 10mL από το διάλυμα στο δοκιμαστικό σωλήνα και προσθέτουμε 5-7 σταγόνες διαλύματος πεψίνης ανακινώντας το σωλήνα ήπια. Κρατώντας το σωλήνα με μικρή κλίση, προσθέτουμε περίπου 5mL παγωμένη αιθανόλη, έτσι ώστε να σχηματιστεί ένα στρώμα αιθανόλης πάνω από το διάλυμα. Τοποθετούμε το σωλήνα στο στατώ και αφήνουμε το διάλυμα σε ηρεμία για 2-3 λεπτά.

Τα νουκλεϊκά οξέα αρχικά συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής μεταξύ διαλύματος και αιθανόλης και σταδιακά αναδύονται στη φάση της αιθανόλης. Χρησιμοποιώντας τη γυάλινη ράβδο ή την παρασχίδα ξύλου της οποίας το άκρο το έχουμε μετατρέψει σε θύσανο, συλλέγουμε τα νουκλεϊκά οξέα που βρίσκονται σε μορφή νήματος στη φάση της αιθανόλης

Θεωρητικές Επισημάνσεις Υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα απομόνωσης του DNA από οργανισμούς φυτικών ιστών (αρακάς, κρεμμύδι, μπανάνα, ακτινίδιο, φράουλα κλπ). Έχοντας γνώση της δομής των φυτικών κυττάρων καθώς και του μορίου του DNA μας βοηθάει να κατανοήσουμε καλύτερα τις τεχνικές με τις οποίες μπορούμε να το απομονώσουμε. Ομογενοποίηση (ομογενοποιώντας το μίγμα με το blender επιτυγχάνεται το σπάσιμο των κυτταρικών και πυρηνικών μεμβρανών καθώς και του κυτταρικού τοιχώματος με μηχανικό τρόπο). Προσοχή χρειάζεται ώστε κατά τη διαδικασία να διατηρείται μέτρια ταχύτητα για πολύ μικρό χρονικό διάστημα (5’-7’ δευτερόλεπτα είναι αρκετά), γιατί ενδέχεται να σπάσει και το DNA. Διήθηση (βοηθάει ώστε να κατακρατούνται τα θραύσματα των μεμβρανών και των οργανιδίων). Απορρυπαντικό ( διασπά τα λιπίδια των κυτταρικών και των πυρηνικών μεμβρανών των κυττάρων, στις οποίες επικρατούν οι υδρόφοβοι δεσμοί των φωσφολιπιδίων). Δείτε πως δρα το απορρυπαντικό πατώντας εδώ Θέρμανση (Διευκολύνεται το σπάσιμο των κυττάρων και αδρανοποιούνται οι νουκλεάσες των κυττάρων οι οποίες διαφορετικά μπορεί να κόψουν τα ινίδια των νουκλεϊκών οξέων σε μικρότερα κομμάτια). Πεψίνη (Είναι ένα ένζυμο η οποία απομακρύνει τις πρωτεΐνες (ιστόνες) οι οποίες είναι συνδεδεμένες με τα μόρια των νουκλεϊκών οξέων). Δείτε πως δρα η πεψίνη πατώντας εδώ Αλάτι (βοηθάει στην καταβύθιση των νουκλεϊκών οξέων καθώς τα ιόντα Na+ σπάζουν τους ηλεκτροστατικούς δεσμούς μεταξύ των πρωτεϊνών και του DNA). Αλκοόλη (η παγωμένη αλκοόλη έχει μικρότερη πυκνότητα από το νερό με αποτέλεσμα να δημιουργούνται 2 φάσεις. Το DNA είναι αδιάλυτο στην αιθανόλη η οποία μαζί με το αλάτι διευκολύνει την καταβύθισή του με αποτέλεσμα αυτό να αναδύεται σταδιακά στη φάση της αιθανόλης).

Βιβλιογραφία Biological Science, A Molecular Approach, BSCS Blue Version, Toby Klang. Εργαστηριακός Οδηγός, Βιολογία Γ’ Θετικής Κατεύθυνσης, Β. Αλεπόρου-Μαρίνου, Α. Αργυροκαστρίτης, Α. Κομητοπούλου, Π. Πιαλόγλου, ΟΕΒΔ. Απομόνωση Νουκλεϊκών Οξέων, ΕΚΦΕ Χαλανδρίου & Ν. Ιωνίας. Απομόνωση Νουκλεϊκών Οξέων, ΕΚΦΕ Αργολίδος. Φωτογραφίες ( Μ. Μπαρμπαρή, Φ. Εγγλεζάκη). Iternet, http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/ (How to extract DNA from everything living).