15.2

15.2 Εφαρμογές μοριακής γενετικής στον καθορισμό κινδύνου επανεμφάνισης

Μέθοδοι μοριακής βιολ. για προσδιορισμό κινδύνου επανεμφάνισης Τα γονίδια που ευθύνονται για πολλές διαταραχές είναι δυνατόν να ανιχνευθούν άμεσα στους φορείς και στα νοσούντα άτομα με τις νέες τεχνικές ανάλυσης του DNA. Οι νέες αυτές τεχνικές έχουν βελτιώσει σημαντικά τον προσδιορισμό των φορέων και έχουν βοηθήσει την ανάπτυξη της προγεννητικής διάγνωσης. Σε πολλές περιπτώσεις είναι δυνατόν να προσδιορίσουμε την παρουσία ή την απουσία ενός ειδικού γονιδίου με ακρίβεια 100%. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι προσδιορισμού του κινδύνου επανεμφάνισης της ασθένειας μέσω προσδιορισμού των φορέων, όσον αφορά την ανάλυση του DNA : Η έμμεση μέθοδος και η άμεση μέθοδος.

Μέθοδοι μοριακής βιολ. για προσδιορισμό κινδύνου επανεμφάνισης Πρωτη μέθοδος (Έμμεση) Η πρώτη μέθοδος αφορά τη χρήση σηματοδοτών στενά συνδεδεμένων με το γονίδιο (RFLPs), (βλ. Κεφ. 4). Αυτή η μέθοδος είναι έμμεση, αλλά μας δίνει καλά αποτελέσματα όταν πληρούνται οι εξής όροι: Πρέπει να υπάρχει στενή σύνδεση ανάμεσα στη μετάλλαξη και στον σηματοδότη, έτσι ώστε να είναι απίθανο να συμβεί ανασυνδιασμός. Η οικογένεια πρέπει να είναι πληροφοριακή, δηλαδή, να υπάρχουν κύρια μέλη της οικογένειας που να μπορούν να μελετηθούν και να είναι ετερόζυγοι τόσο για την μετάλλαξη όσο και για τους σηματοδότες. Η φάση σύνδεσης να είναι γνωστή ή να συνεπάγεται εύκολα, Να μην έχει συμβεί επιχιασμός ανάμεσα στους σηματοδότες και στο γονίδιο της ασθένειας. Σε πολλές περιπτώσεις, με την παραπάνω μέθοδο μπορούμε να αποκτήσουμε πληροφορίες που τροποποιούν τον προγενέστερο κίνδυνο ορισμένων μελών της οικογένειας, φορέων της ασθένειας.

Μέθοδοι μοριακής βιολ. για προσδιορισμό κινδύνου επανεμφάνισης Δεύτερη μέθοδος (Άμεση) Η δεύτερη μέθοδος περιλαμβάνει άμεσο προσδιορισμό της μετάλλαξης, χρησιμοποιώντας το γονίδιο, και cDNA ή σιινθετικούς ανιχνευτές προκειμένου να ανιχνευθεί η μετάλλαξη στο γενωμικό DNA του ασθενούς ή άλλων μελών της οικογένειας (βλ. Κεφ. 4). θ Οι άμεσοι μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο όταν είναι γνωστή η μετάλλαξη που δημιουργεί την εν λόγω διαταραχή.

Κλινικά συμπτώματα της μυικής δυστροφίας Ανάλυση σύνδεσης στη μυϊκή δυστροφία τύπου Duchenne Η μυϊκή δυστροφία είναι κληρονομική φυλοσύνδετη νόσος που χαρακτηρίζεται κλινικά από : uπροσβολή των μυών της πυελικής ζώνης και των ώμων, uψευδοϋπερτροφία των μυών της γαστροκνημίας και uπροοδευτική βλάβη του καρδιακού μυός. Εμφανίζεται με συχνότητα 1:3.500 γεννήσεις αρρένων. Βαρύτερη κλινική εικόνα εμφανίζει ο τύπος Duchenne, ο οποίος εκδηλώνεται στα τρία πρώτα χρόνια της ζωής και οι άρρωστοι καταλήγουν συνήθως στη δεύτερη δεκαετία με συμπτώματα καρδιακής και αναπνευστικής ανεπάρκειας. Αντίθετα, η μυϊκή δυστροφία τύπου Becker εκδηλώνεται κλινικά ηπιότερα, συνήθως μετά την πρώτη δεκαετία, και οι άρρωστοι παρουσιάζουν μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης.

Το γονίδιο της μυικής δυστροφίας Το γονίδιο το υπεύθυνο και για τους δυο τύπους μυϊκής δυστροφίας εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος Χ (Xq 21.2) και η αλληλουχία του DNA έχει πλήρως αναλυθεί τα τελευταία χρόνια. Το γονίδιο της μυϊκής δυστροφίας είναι το μεγαλύτερο που έχει αναλυθεί μέχρι σήμερα και περιέχει 70 εξώνια !! που κωδικοποιούν μια ειδική πρωτεΐνη των μυών, τη δυστροφίνη. (Η πρωτεΐνη αυτή συμμετέχει στο ενδοκυτταρικό τμήμα της κυτταρικής μεμβράνης ενισχύοντας την αντοχή του λιπιδικού στρώματος, ενώ συμμετέχει παράλληλα στο μεταβολισμό του ασβεστίου.) Λεπτομερής ανάλυση της αλληλουχίας του DNA σε ασθενείς και των δύο τύπων μυϊκής δυστροφίας απέδειξε ότι υπάρχει μεγάλη ετερογένεια όσον αφορά τη μοριακή βλάβη η οποία σχετίζεται με τη διαφορετική κλινική συμπτωματολογία που παρουσιάζουν οι δύο τύποι της νόσου. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (65-70%) διαπιστώθηκε η παρουσία ελλείψεων ή διπλασιασμών σ' ένα ή περισσότερα εξώνια. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις ανιχνεύθηκαν, πρόσφατα, ποικίλες σημειακές μεταλλάξεις υπεύθυνες για τη νόσο,

Το γονίδιο της μυικής δυστροφίας Στις περιπτώσεις που είναι γνωστές οι ελλείψεις ή οι σημειακές μεταλλάξεις που ευθύνονται για τη νόσο, εφαρμόζεται άμεσος τρόπος ελέγχου τόσο για την προγεννητικήδιάγνωση όσο και για τον εντοπισμό των φορέων. Σε πολλές όμως οικογένειες χρησιμοποιείται ο έμμεσος τρόπος ελέγχου με τη χρήση των κατάλληλωνπολυμορφικών σημείων που συνδέονται με το παθολογικό χρωμόσωμα. Η διαδικασία αυτή παρουσιάζει αρκετές δυσκολίες λόγω του μεγάλου μεγέθους του γονιδίου που ευνοεί τη δημιουργία ανασυνδυασμών του DNA (σε ποσοστό μέχρι 10%) μεταξύ των πολυμορφικών σημείωνκαι των γονιδίων. οι δυσκολίεςαυτές αυξάνονται σε οικογένειες με νέα (de novo) μετάλλαξηκαι μικρό συνήθως αριθμό ατόμων με το παθολογικό γονίδιο.

Το υποθετικό γενεαλογικό δένδρο που φαίνεται στην εικόνα δείχνει τον τρόπο που εφαρμόζεται η χρήση σηματοδοτών σύνδεσης στην ανίχνευση φορέων, καθώς και στον προγεννητικό έλεγχο.

Ανάλυση μυικής δυστροφίας με ανιχνευτές cDNA Περίπου 60% των ασθενών με μυϊκή δυστροφία Duchenne εμφανίζουν ελλείψεις μέσα στο γονίδιο. Πολλές απ' αυτές τις ελλείψεις είναι δυνατόν να ανιχνευθούν με μια σειρά ανιχνευτών cDNA. Στο γενεαλογικό δένδρο που φαίνεται στην Εικόνα (της προηγούμενης σελίδας) αν ο ασθενής II-4 είχε μια ανιχνεύσιμη έλλειψη, τότε η ανάλυση σύνδεσης που περιγράφηκε παραπάνω δεν θα ήταν απαραίτητη. Θα μπορούσε να γίνει εξέταση του DNA του εμβρύου για την ανίχνευση ή όχι της έλλειψης προκειμένου να γίνει διάγνωση. Προς το παρόν, η ανίχνευση έλλειψης σ' ένα ετερόζυγο θηλυκό άτομο δεν είναι απολύτως ασφαλής στις περισσότερες περιπτώσεις, παρόλο που η τεχνολογία διαρκώς βελτιώνεται Η ανίχνευση των μεταλλάξεων γονιδίου στα θηλυκά μέλη της οικογένειας συνήθως απαιτεί τη χρήση συνδεδεμένων σηματοδοτών.

Ανίχνευση μεταλλάξεων στην κυστική ίνωση Η κυστική ίνωση είναι η συχνότερη κληρονομική νόσος στη λευκή φυλή (βρίσκεται στη δεύτερη θέση από πλευράς συχνότητας μετά τη θαλασσαιμία) και χαρακτηρίζεται από: δυσλειτουργία των εξωκρινών αδένων με κύριες εκδηλώσεις του αναπνευστικού και πεπτικού συστήματος και των ιδρωτοποιών αδένων.

Ανίχνευση μεταλλάξεων στην κυστική ίνωση Κληρονομείται ως υπολειπόμενη αυτοσωμική νόσος και η συχνότητα των φορέων στο γενικό πληθυσμό της χώρας μας υπολογίζεται σε 4-5%. Οι κλινικές εκδηλώσεις της νόσου αποδίδονται σε διαταραχή της διαμεμβρανικής διακίνησης ιόντων CI και Na, με αποτέλεσμα τη μείωση του ύδατος και των ηλεκτρολυτών και τη δημιουργία παχύρρευστης βλέννης, που οδηγεί σε αποφρακτική πνευμονοπάθεια και δυσλειτουργία των ιδρωτοποιών αδένων και του παγκρέατος. Το 90% των ασθενών υποφέρουν από αναπνευστική ανεπάρκεια. Επίσης λόγω της παγκρεατικής ανεπάρκειας παρουσιάζονται προβλήματα στο πεπτικό σύστημα, ενώ από τους ιδρωτοποιούς αδένες υπάρχει μεγάλη αποβολή ύδατος και ηλεκτρολυτών, με αποτέλεσμα σοβαρές ηλεκτρολυτικές διαταραχές κυρίως κατά τους θερινούς μήνες. Σημαντική πρόοδο στον τομέα της πρόληψης, που δημιουργεί και προϋποθέσεις για μόνιμη θεραπευτική αντιμετώπιση στο μέλλον (γονιδιακή θεραπεία), αποτέλεσε η μελέτη της μοριακής διαταραχής της νόσου τα τελευταία πέντε χρόνια.

Το γονίδιο της κυστικής ίνωσης Το 1986 βρέθηκε ότι το υπεύθυνο γονίδιο για τη νόσο είναι στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 7. Με τη χρησιμοποίηση κατάλληλων πολυμορφικών σημείων που συνδέονται με το γονίδιο της νόσου έγινε δυνατή η προγεννητική διάγνωση σε οικογένειες που είχαν ήδη άρρωστο παιδί. Η ανάλυση του γονιδίου έδειξε ότι πρόκειται για μεγάλου μεγέθους γονίδιο (250 kb) που περιλαμβάνει 27 εξώνια. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο αυτό αποτελείται από 1.480 αμινοξέα και ονομάζεται ρυθμιστής διαμεμβρανικής διακίνησης ιόντων. Η δομή της έχει μεγάλη ομοιότητα με τις πρωτεΐνες της μεμβράνης των βακτηρίων και των θηλαστικών που συμμετέχουν στη ρύθμιση της μεταφοράς ιόντων.

Το γονίδιο της κυστικής ίνωσης Με τη χρήση τεχνικών ανάλυσης DNA βρέθηκαν περίπου 200 μεταλλάξεις ! υπεύθυνες για την ασθένεια. Η συχνότερα συναντώμενη είναι εκείνη που αφορά την έλλειψη τριών νουκλεοτιδίων στο εξώνιο 10 και οδηγεί στη σύνθεση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης, από την οποία λείπει το αμινοξύ φαινυλαλανίνη. Η μετάλλαξη αυτή αφορά το 70% του συνόλου των μεταλλάξεων της νόσου και στην Ελλάδα απαντάται σε συχνότητα 50%. Τα ομόζυγα άτομα τα οποία εμφανίζουν την παραπάνω μετάλλαξη παρουσιάζουν βαριά παγκρεατική ανεπάρκεια. Η ανίχνευση των φορέων και ο προγεννητικός έλεγχος βασίζονται στο ότι το 70% των μεταλλάξεων της ασθένειας αυτής είναι του ίδιου τύπου, όπως ήδη αναφέρθηκε. Για την ανίχνευση φορέων της μετάλλαξης και τον προγεννητικό έλεγχο χρησιμοποιείται η αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (PCR) και η υβριδοποίηση με τα ολιγονουκλεοτίδία συγκεκριμένων αλληλόμορφων (ASO) (βλ. Κεφ. 4). Η μέθοδος αυτή μας δίνει πληροφορίες στο 50% των οικογενειών με ένα άρρωστο παιδί και εν μέρει πληροφορίες στο 40% των περιπτώσεων, ενώ δεν εφαρμόζεται στο 30% των μεταλλάξεων που δεν εμφανίζουν την ανωτέρω μετάλλαξη και δεν ανιχνεύονται με αυτή τη δοκιμασία. Εντούτοις, όσο μελετάται η ασθένεια τόσο θα δίνεται η δυνατότητα να δημιουργηθούν άμεσες τεχνικές για την ανίχνευση όλων των περιπτώσεων. Στην περίπτωση που δεν είναι δυνατός ο άμεσος προσδιορισμός, εφαρμόζεται η ανάλυση σύνδεσης.

Περιπτώσεις οπου το γονίδιο δεν έχει κλωνοποιθεί Τα παραδείγματα που αναφέραμε προηγουμένως αφορούν τις διαταραχές της κυστικής ίνωσης και της μυϊκής δυστροφίας στις οποίες το υπεύθυνο γονίδιο έχει κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί. Σ' αυτές τις διαταραχές έχουν αναλυθεί πολλές μεταλλάξεις (μελέτη με υβριδοποίηση με cDNA) και έχουν επίσης προσδιοριστεί πολυμορφισμοί του DNA (μελέτη σύνδεσης με πολυμορφ.δείκτες) . Εντούτοις, στις περισσότερες διαταραχές το υπεύθυνο γονίδιο δεν έχει κλωνοποιηθεί. Σ' αυτές τις περιπτώσεις, η διάγνωση είναι πολύπλοκη και δαπανηρή, ακόμη και αν η θέση του γονιδίου είναι γνωστή λόγω των γενετικών αποστάσεων μεταξύ αυτού και των σηματοδοτών που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση. Ο καθορισμός του κινδύνου επανεμφάνισης της νόσου, με σκοπό να δοθεί ακριβής γενετική καθοδήγηση, περιλαμβάνει διεξοδικές μελέτες των περιοσσότερων μελών της οικογένειας με διάφορους ανιχνευτές DNA προκειμένου να γίνει συλλογή πληροφοριών για τη θέση και την παρουσία πιθανών ανασυνδυασμών. ¨Ενα παράδειγμα τέτοιας περίπτωσης είναι το σύνδρομο Marfan.(επόμενη σελίδα)

Το σύνδρομο Marfan Η Εικόνα δείχνει το γενεαλογικό δένδρο μιας οικογένειας με σύνδρομο Marfan, μια αυτοσωμική διαταραχή του συνδετικού ιστού που χαρακτηρίζεται από υψηλό, πολύ λεπτό ανάστημα, σκελετικές ανωμαλίες και μερικές φορές σοβαρές καρδιακές επιπλοκές (βλ.Εικόνα). Λόγω του ότι το γονίδιο του συνδρόμου Marian έχει χαρτογραφηθεί με ανάλυση σύνδεσης και βρίσκεται στο μεγάλο βραχίονα τον χρωμοσώματος 15, είναι δυνατόν με μοριακές τεχνικές ανάλυσης του DNA να γίνει προσδιορισμός του κινδύνου επανεμφάνισης της ασθένειας στα μέλη μιας οικογένειας. Ένας σηματοδότης του DNA στο χρωμόσωμα 15 έχει περίπου 10% ανασυνδυασμό με το γονίδιο Marian. Κατά συνέπεια, η γονοτυπική πληροφορία που αποκτάται από το σηματοδότη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλεφθεί η παρουσία ή απουσία του γονιδίου Marian.

Το σύνδρομο Marfan Στην οικογένεια που φαίνεται στην εικόνα η προγενέστερη πιθανότητα να φέρει το άτομο ΙΙΙ-3 το γονίδιο Marfan είναι 1/2. Επιπλέον, έχει κληρονομήσει, όπως και ο μη άρρωστος αδελφός της, το ίδιο αλληλόμορφο στη θέση του σηματοδότη του DNA από την άρρωστη μητέρα της. Εντούτοις, λόγω του ότι υπάρχει πιθανότητα επιχιασμού μεταξύ του γονιδίου Marian και του γονιδίου του σηματοδότη σε μία ή περισσότερες μειώσεις μέσα στην οικογένεια, δεν είναι δυνατόν να γίνει διάγνωση με απόλυτη βεβαιότητα. Ο τελικός κίνδυνος να φέρει η III-3 το γονίδιο Marian υπολογίζεται σε 10%.