Π.Παπαζαφείρη , Α. Φωτεινοπούλου Ασκήσεις Ανοσολογίας Αντιδράσεις αντιγόνου αντισώματος σε ημιδιαπερατά μέσα Αντιδράσεις κατακρήμνισης Ανοσοδιάχυση (άσκηση 5) Ag: ορός ανθρώπου Ab: αντι-ορός (έναντι ορού ανθρώπου) Ανοσοηλεκτροφόρηση (άσκηση 6) Ab: (ηλεκτροφόρηση): αντι IgX Π.Παπαζαφείρη , Α. Φωτεινοπούλου

Αντιδράσεις κατακρήμνισης= σχηματισμός ιζήματος ιn vitro

Ζώνη ισοδυναμίας: σχηματισμός ιζήματος

Τύποι αντιδράσεων κατακρήμνισης σε υγρό μέσο σε ημιδιαπερατά μέσα σε πήκτωμα διπλή ανοσοδιάχυση (Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση – rocket ηλεκτροφόρηση σε λεπτή γέλη αγαρόζης ανοσοκαθήλωση

Ζώνη ισοδυναμίας: σχηματισμός ιζήματος σε ημιδιαπερατά μέσα Ζώνη ισοδυναμίας: σχηματισμός ιζήματος σε ημιδιαπερατά μέσα

Ανοσοδιάχυση, πλεονεκτήματα Μπορεί να αναλυθεί ένα πολυδύναμο σύστημα αντιγόνων- αντισωμάτων Αν για παράδειγμα, ανοσοποιηθεί ένα κουνέλι με ορό ανθρώπου, κάθε συστατικό του ορού του ανθρώπου (όπως πχ αλβουμίνη, IgG, τρανσφερίνη, κλπ) θα οδηγήσει στο σχηματισμό αντισωμάτων ειδικών για αυτό. ΄Οταν, τοποθετηθεί ο αντιορός του κουνελιού σε ένα φρεάτιο και ο ορός του ανθρώπου σε ένα άλλο φρεάτιο, θα δημιουργηθούν αρκετές ευδιάκριτες γραμμές ιζήματος ανάμεσα στα δύο φρεάτια και κάθε γραμμή θα αντιπροσωπεύει ένα διαφορετικό σύστημα συμπλόκων αντιγόνου-αντισώματος: αλβουμίνης-αντι-αλβουμίνης, IgG-αντι-IgG, τρανσφερίνης-αντι-τρανσφερίνης, κλπ. Εύκολη και οικονομική μεθοδολογία

Καθορισμός ταυτότητας με τη μέθοδο της διπλής ανοσοδιάχυσης Αντίδραση ταυτότητας Αντίδραση μη ταυτότητας Αντίδραση μερικής ταυτότητας

Διπλή ανοσοδιάχυση Ouchterlony

Διπλή ανοσοδιάχυση Ouchterlony δυνατότητα ποσοτικοποίησης

Πειραματική διαδικασία Διπλή ανοσοδιάχυση (Ouchterlony) θέση Αραίωση Αb A1 1:20(v/v) A2 1:40 A3 1:80 Α4 1:160 Β1 1:50 Β2 1:100 Β3 1:200 Β4 1:400 Σε προκαλυμμένες αντικειμενοφόρους πλάκες προσθέτουμε 5 ml πυκνού άγαρ το οποίο δεν περιέχει αντιορό. Ag 1 2 6 3 5 4 A B Αλλαγή: Α1-4 Β1-4 1:160 1:20 1:40 1:80 1:400 1:50 1:200 1:100 Ag Μετά από επώαση περίπου 24 ωρών και χρώση, παρατηρούμε και καταγράφουμε τα πρότυπα ανοσοκατακρήμνισης.

Πειραματική διαδικασία Μονή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Μέθοδος Mancini) Σε 5ml πυκνού διαλύματος άγαρ (2% w/v), το οποίο διατηρείται σε θερμοκρασία 56°C, προσθέτονται 0,1 ml αντιορού και 0,9 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών. Μετά την στερεοποίηση του επιχρίσματος του αραιού άγαρ, προσθέτουμε το πυκνό άγαρ και το απλώνουμε προσεκτικά έτσι ώστε να δημιουργηθεί πήκτωμα σε όλη την επιφάνεια της πλάκας. Μετά την στερεοποίηση της πηκτής του άγαρ, ανοίγουμε 7 φρεάτια με τη βοήθεια πιπέττας Pasteur Η συγκέντρωση του αντιγόνου στο αρχικό διάλυμα (θέση 1) είναι 6.2 mg/ml 1 2 3 4 5 6 Θέση 7: αντιγόνο άγνωστης συγκέντρωσης Δείγμα 10μl Αραιώσεις ν/ν: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Χ

Ακτινωτή ανοσοδιάχυση Mancini Log αραίωσης Η ακτινωτή ανοσοδιάχυση είναι ημι-ποσοτική μέθοδος. Κατά κανόνα το αντίσωμα διαλύεται (ομοιόμορφα) στο πήκτωμα πριν την προσθήκη του μίγματος των αντιγόνων

Πειραματική διαδικασία ανίχνευση των ιζημάτων ανοσοδιάχυσης Πειραματική διαδικασία ανίχνευση των ιζημάτων ανοσοδιάχυσης Τοποθετούμε την αντικειμενοφόρο πλάκα σε δοχείο, με υγρασία, για 3-24 ώρες, μέχρις ότου εμφανιστούν οι γραμμές ιζήματος. Αφαιρούμε τις πρωτεΐνες που δεν έχουν δεσμευθεί με ανάδευση της πηκτής σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) για 12 ώρες με τρεις αλλαγές. Καλύπτουμε την πηκτή με υγρό διηθητικό χαρτί, και την τοποθετούμε σε κλίβανο, στους 100°C για 30 λεπτά, έτσι ώστε να γίνει αφυδάτωση και διαφανοποίησή της. Χρωματίζουμε με χρωστική Coomassie brilliant blue για 10 - 20 λεπτά, έως ότου γίνουν ορατοί οι δακτύλιοι ιζήματος. Αποχρωματίζουμε με ανάδευση σε διάλυμα αποχρωματισμού με τρεις αλλαγές. Με τη βοήθεια ενός χάρακα μετράμε τη διάμετρο όλων των δακτυλίων.

Πειραματική διαδικασία Ανοσοηλεκτροφόρηση Η ανοσοηλεκτροφόρηση έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, αφού συνδυάζει τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό διαφόρων αντιγόνων και τη δημιουργία συμπλόκων των διαφορετικών αυτών αντιγόνων με τις ανοσοσφαιρίνες που έχουν παραχθεί σε ένα αντιορό

Ανοσοηλεκτροφόρηση Σημειώστε τη «σχετική» θέση κάθε ανοσοσφαιρίνης Το μίγμα αντιγόνων ηλεκτροφορείται πρώτα για να διαχωριστούν τα συστατικά του Χρησιμοποιείται σε κλινικά εργαστήρια για την διαπίστωση έλλειψης ή υπερ-παραγωγής ισοτύπων ή παρουσίας «ξένων» πρωτεϊνικών συστατικών Σημειώστε τη «σχετική» θέση κάθε ανοσοσφαιρίνης

Πειραματική διαδικασία Ανοσοηλεκτροφόρηση Μετά την στερεοποίηση της πηκτής του άγαρ, ανοίγουμε δύο φρεάτια Προσθέτουμε σε κάθε φρεάτιο 10μl μίγματος αντιγόνων Τοποθετούμε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, έτσι ώστε τα δείγματα που θα ηλεκτροφορηθούν να βρίσκονται προς την κάθοδο. Σχηματίζουμε γέφυρες τοποθετώντας διηθητικά χαρτιά που έχουν διαβραχεί στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης Ag Ab Φρεάτια τοποθέτησης αντιγόνων Αυλάκι τοποθέτησης αντιορού

Πειραματική διαδικασία Ανοσοηλεκτροφόρηση Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης ανοίγουμε με νυστέρι ένα αυλάκι και αφαιρούμε το πήκτωμα με τη βοήθεια μιας βελόνας. Γεμίζουμε το αυλάκι με τον αντιορό και γρήγορα τοποθετούμε την πηκτή σε δοχείο με αρκετή υγρασία, στους 4°C για 24 ώρες, μέχρις ότου σχηματιστεί το πρότυπο της ανοσοκατακρήμνισης. Αποτυπώνουμε και ταυτοποιούμε τα πρότυπα των ιζημάτων.

Ανοσοκαθήλωση Από Άσκηση 11 Φυσιολογία Ζώων Πρότυπα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ορού σε ταινίες κυτταρίνης

Ανοσοκαθήλωση

Ανοσοκαθήλωση Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

Ανοσοκαθήλωση Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgG λ

Αξιολόγηση αποτελεσμάτων 1. Ouchterlony: Παρατηρούμε και καταγράφουμε τα πρότυπα ανοσοκατακρήμνισης. Σημειώνουμε τη μεγαλύτερη αραίωση αντισώματος που μπορεί να σχηματίσει ίζημα με το αντιγόνο. θέση Αραίωση Αb A1 1:20(v/v) A2 1:40 A3 1:80 Α4 1:160 Β1 1:50 Β2 1:100 Β3 1:200 Β4 1:400 Ag 1 2 6 3 5 4 A B Αλλαγή: Α1-4 Β1-4 1:160 1:20 1:40 1:80 1:400 1:50 1:200 1:100 Ag

Αξιολόγηση αποτελεσμάτων 2. Mancini: Με βάση τις συγκεντρώσεις του προτύπου και τις τιμές της διαμέτρου των αντίστοιχων δακτυλίων κατασκευάζουμε πρότυπη καμπύλη. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης και με βάση τη διάμετρο του δακτυλίου, μπορούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση του άγνωστου αντιγόνου. Η συγκέντρωση του αντιγόνου στο αρχικό διάλυμα (θέση 1) είναι 6.2 mg/ml 1 2 3 4 5 6 Θέση 7: αντιγόνο άγνωστης συγκέντρωσης Δείγμα 10μl Αραιώσεις ν/ν: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Χ

Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Ηλεκτροφόρηση: ταυτοποίηση του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανάλογα με το πρότυπο των ιζημάτων Επιχειρούμε μια συγκριτική αξιολόγηση των δύο μεθόδων (ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση)