1Patrik Stanić, 1Višnja Hlavati, 2Sanda Koprivc Varga i 2Danko Dobec Vitrifikacija oocita i sekundarni ICSI – doprinos kumulativnom uspjehu liječenja 1Patrik Stanić, 1Višnja Hlavati, 2Sanda Koprivc Varga i 2Danko Dobec 1Klinika za ženske bolesti i porode Kliničkog bolničkog centra Zagreb 2Poliklinika IVF Zagreb

Kultivacija gameta i zametaka IVF/ICSI Kultivacija 18-20 h Priprema hranilišta i otopina Izdvajanje i koncentriranje spermija Stimulacija jajnika Aspiracija folikula Izdvajanje oocita IVF/ICSI Prikupljanje ejakulata Kriopohrana Sekundarni ICSI Kultivacija 18-20 h Kriopohrana Potvrda oplodnje (2PRN) Promjena hranilišta Kriopohrana Kultivacija 24 h Broj i morfologija zametaka Kultivacija gameta i zametaka Transfer embrija 2/3 dan Kultivacija 24 h Promjena hranilišta Kultivacija 24-48 h Transfer morula/blastocista

Kumulativno povećanje stupnja trudnoća po aspiriranim oocitama IVF/ICSI ZAMRZAVANJE EMBRIJA ZAMRZAVANJE OOCITA KUMULATIVNO TRUDNOĆE (najrelevantniji indeks uspjeha)

Indikacije za zamrzavanje humanih embrija smanjenje broja transferiranih embrija smanjenje višeplodnih trudnoća odgoda ET (OHSS, endometralni polip) zakonske odredbe o zabrani ET više od jednog embrija

Indikacije za zamrzavanje humanih oocita kemoterapija ili radijacijska terapija kirurške operacije na spolnom sustavu donorska banka oocita odgađanje majčinstva zakonske odredbe o ograničenju broja oplođenih oocita

Procesi zamrzavanja i odmrzavanja toplinski šok unutarstanično stvaranje kristala leda dehidracija i rehidracija početna kvaliteta gameta i zametaka sastav medija za zamrzavanje postupak zamrzavanja i odmrzavanja

Moguća oštećenja oocita tijekom kriopohrane Utjecaj na fiziologiju i starenje oocite Oštećenja citoplazme i citoskeleta Propusnost membrane Stvrdnuće zone pellucide Depolimerizacija diobenog vretena Degeneracija polarnog tjelešca

Kriopohrana oocita – odabir metode, medija i nosača Sporo zamrzavanje COOK, MediCult, Vitrolife Vitrifikacija Kitazato, MediCult, Irvine Scientific cryotop cryoleaf cryoloop cryotip

Krioprotektori Permeabilni krioprotektori glicerol, etilenglikol (EG), 1,2-propandiol (PROH), dimetilsulfoksid (DMSO) dehidracija smanjenje točke ledišta ne toksični Ne permeabilni krioprotektori saharoza osmotski pufer

Postupci zamrzavanja Kontrolirano sporo zamrzavanje (Whittingham et al., 1972) Vitrifikacija - ultra brzo zamrzavanje (Rall & Fahy, 1985) Kontrolirano sporo zamrzavanje Vitrifikacija Konc. krioprotektora 1,5 M 3,0-5,0 M Volumen 0,3-1,0 ml <1 μl Kontakt N2 i stanice Ne Da Stupanj hlađenja ~ 0,5°C/min 15.000 – 50.000°C/min Zamrzavanje Sporo Ultrabrzo Odmrzavanje Brzo Vrijeme postupka ≥ 180 min. 2 sec. Dehidracija Nije kontrolirana Kontrolirana Lomovi zone pelucide Moguće Stvaranje kristala leda Smanjenje osmotskog stresa

Sporo zamrzavanje vs vitrifikacija 50-76% stupanj preživljenja 13-38% stupanj trudnoća/ET (Porcu 2000, Boldt 2006, Borini 2007) 91% stupanj preživljenja (La et al., 2010) vitrifikacija 63-100% stupanj preživljenja 6,4-61% stupanj implantacije (Cobo, 2009)

Sporo zamrzavanje vs vitrifikacija mnoge studije su retrospektivne, ne komparativne podaci o trudnoćama nedostatni za analize preživljenje embrija/blastocista favorizira vitrifikaciju (Loutradi, 2008) razvoj do stadija blastociste iz zamrznutih embrija u stadiju diobe favorizira vitrifikaciju nema statistički značajne razlike u stupnju kliničkih trudnoća/ET

Vitrifikacija oocita: rezultati Cryotop metode Cryotop metoda EG / DMSO + saharoza broj vitrificiranih oocita (MII) 111 stupanj preživljenja 95% stupanj oplodnje (ICSI) 91% razvoj blastociste 50% stupanj trudnoća/ET (2,2 zametka/ET) 41% Kuwayama M. Theriogenology 2007.

Vitrifikacija oocita: rezultati Cryotop metode Vitrificirane oocite Svježe oocite Stupanj preživljenja (%) 96,7% Stupanj oplodnje (%) 76,3% 82,2% Dioba na dan 2 94,2% 97,8% Dioba na dan 3 80,8% 80,5% Razvoj blastociste (%) 48,7% 47,5% Cobo et al., Fertil Steril 2007.

Vitrifikacija oocita - McGill Reproductive Center Pacijentice (ciklusa) 25 (25) Dob pacijentica 31.8 ± 3.6 Broj odmrznutih oocita 283 (11.3 ± 5.9) Broj preživjelih oocita (%) 253 (89.4) Broj oplođenih oocita (%) 179 (72.7) Broj oocita u diobi (%) 155 (80.0) Broj transferiranih embrija 92 (3.7 ± 1.1) Broj kliničkih trudnoća (%) 11 (44.0) Broj implantiranih embrija (%) 15 (20.7) Chian et al. (2005) ASRM Annual Meeting

Nove strategije u kliničkoj primjeni – IVM + vitrifikacija oocita pacijentice oboljele od malignih bolesti IVM postupak nezrelih oocita + vitrifikacija izbjegnuta hormonska stimulacija odgoda majčinstva čuvanje plodne sposobnosti program donacije oocita potencijalna donorica izbjegava hormonsku stimulaciju

Trudnoće nakon vitrifikacije oocita u mladih plodnih pacijentica (n) odmrznutih oocita 395 (n) stupanj preživljenja oocita (%) 320 (81,0%) 2 PRN 72,3% (n) embrija / (n) ET 53/19 (n) kliničke trudnoće/ET (%) 16/19 (80%) (n) implantiranih embrija (%) 24 (45,3%) živorođena djeca/odmrznuta oocita 5,1 % Kim TJ et al., Fertil Steril 2010

Klinički ishod – sporo zamrzavanje oocita neplodnih pacijentica (n) ciklusa s odmrzavanjem oocita 940 stupanj preživljenja oocita 55,8% 2 PRN 72,5% kliničke trudnoće/ciklus 13,7% kliničke trudnoće/ET 17,0% implantacija 10,1% Borini et al., Fertil Steril 2010

Kumulativni rezultati – trudnoće prije i nakon uvođenja ograničenja oplodnje Kumulativne trudnoće sa zamrznutim embrijima (1992-2004) Kumulativne trudnoće sa zamrznutim oocitama (2004-2008) sve pacijentice 50% 49% ≤34 54% 53% 35-38 52% 39-40 34% 47% 41-43 25% >=43 15% 26% Borini et al., 2008.

Klinički ishod – vitrifikacija oocita neplodnih pacijentica Pacijentice (N=40) (n) odmrznutih oocita 3,1 (n) transferiranih zametaka 2,3 (n) ET 39/40 (97,5%) kliničke trudnoće/ciklus 15/40 (37,5%) kliničke trudnoće/ET 15/39 (38,5%) implantacija 19/93 (20,4%) Rienzi et al., Human Reproduction 2009

Kumulativni rezultati – trudnoće nakon svježeg ciklusa te vitrifikacije oocita u neplodnih pacijentica Svježi ciklus I ciklus odmrzavanja II ciklus odmrzavanja sve pacijentice 66/182 (37,4%) 94/182 (51,6%) 97/182 (53,3%) ≤34 29/72 (40,2%) 45/72 (62,5%) 35-37 20/48 (41,7%) 23/48 (47,9%) 24/48 (50,0%) 38-40 15/41 (36,6%) 20/41 (48,8%) 21/41 (51,2%) 41-43 4/21 (19,0%) 6/21 (28,6%) 7/21 (33,3%) Rienzi Laura. Oral Presentation ESHRE Campus 2010 “The search for excellence in IVF: a practical approach”

KLINIČKI BOLNIČKI CENTAR ZAGREB Kumulativni rezultati za 2010 godinu – trudnoće po stimuliranom ciklusu u neplodnih pacijentica sa zamrznutim oocitama Svježi ciklus I ciklus odmrzavanja Broj pacijentica 79 29 Dob pacijentica 32 33,2 Broj oocita 9,7 (770/79) 3,2 (94/29) Stupanj preživljenja oocita 65% (61/94) Stupanj oplodnje 79% 69% Stupanj implantacije 20,4% 12,2% Stupanj trudnoća/ET 44% (34/77) 17,8% (5/28) Kumulativno trudnoće/ stimulirani ciklus 49,4% (39/79)

POLIKLINIKA IVF ZAGREB Kumulativni rezultati za 2010 godinu – trudnoće po stimuliranom ciklusu u neplodnih pacijentica sa zamrznutim oocitama Svježi ciklus I ciklus odmrzavanja Broj pacijentica 45 20 Dob pacijentica 35 36 Broj oocita 7,8 (351/45) 2,6 (52/20) Stupanj preživljenja oocita 76,9% (40/52) Stupanj oplodnje 78% 72% Stupanj implantacije 14% 17,2% Stupanj trudnoća/ET 34,8% (15/43) 29,4% (5/17) Kumulativno trudnoće/ stimulirani ciklus 44,4% (20/45)