Απομόνωση και ταυτοποίηση Ανοσοσφαιρινών Άσκηση 2 Απομόνωση και ταυτοποίηση Ανοσοσφαιρινών Ρ. Τσιτσιλώνη Π. Παπαζαφείρη Α. Φωτεινοπούλου Σ. Παπαβασιλείου

Απομόνωση ανοσοσφαιρινών Σκοπός άσκησης: απομόνωση των αντισωμάτων τάξης G από το σύνολο των πρωτεϊνών ορού ή πλάσματος με μεθόδους υγρής χρωματογραφίας μαζική απομόνωση χρωματογραφία σε στήλη

Ανοσοσφαιρίνες/αντισώματα Παράγονται σε απόκριση εισβολής ανοσογόνου μεμβρανοσυνδεόμενες (επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων) εκκριτικά προϊόντα των πλασματοκυττάρων: δραστικά μόρια χυμικής ανοσίας κυκλοφορούν στο πλάσμα και είναι υπεύθυνα για τη δέσμευση και την εξουδετέρωση του αντιγόνου έναντι του οποίου έχουν παραχθεί Εκτελεστικό Β-κύτταρο (πλασματοκύτταρο) Β-κύτταρο μνήμης Β κύτταρο+ανοσογόνο

Πρωτεΐνες πλάσματος αντισώματα

Δομή ανοσοσφαιρινών Fab κ, λ γ,μ,α,δ,ε

Πρωτογενής και δευτερογενής απάντηση χρόνος εμφάνισης διάρκεια τίτλος τάξη Ig συγγένεια

Παραγωγή και καθαρισμός αντισωμάτων

Πρωτεϊνικά φορτία και pH pH <pI ---> + φορτίο pH >pI ---> - φορτίο

Ιοντοανταλλάκτες Ανιονικός ανταλλάκτης Κατιονικός ανταλλάκτης

Ιοντοανταλλάκτες Έκλουση με: -Αλλαγή pH -Aλλαγή ιονικής ισχύος

Διαχωρισμός σε κολώνα DEAE κυτταρίνης Δείγμα Διαχωρισμός πρωτεϊνών και συλλογή κλασμάτων Φωτομέτρηση κλασμάτων

Αυτοματοποιημένη συλλογή κλασμάτων Ρυθμιστικό δμα Κολώνα ανταλλάκτη Φωτόμετρο & καταγραφικό Συλλέκτης κλασμάτων

Μαζική απομόνωση ανοσοσφαιρινών Σε κωνική που περιέχει DEAE κυτταρίνη προσθέτουμε 200 μl ορό και αναδεύουμε ΗΠΙΑ Επώαση: 45 min, θερμοκρασία δωματίου / ανάδευση ανά 15 λεπτά Αδειάζουμε στο Τ Φυγοκέντρηση: 1000 στροφές, 5 λεπτά Συλλέγουμε το υπερκείμενο = ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ Α (ανοσοσφαιρίνες) Στο ίζημα προσθέτουμε: 5 ml φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα/1 Μ KCl Επώαση: 15 min, θερμοκρασία δωματίου Συλλέγουμε το υπερκείμενο = ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ Β (υπόλοιπες πρωτεΐνες) Φωτομέτρηση Α και Β: στα 280 nm στα 260 nm

Χρωματογραφία σε στήλη Αφήνουμε να περάσει ρυθμιστικό διάλυμα μέχρι να σχηματιστεί μηνίσκος. Κλείνουμε τη στρόφιγγα ροής και επιστιβάζουμε ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ 200 μl ορό Ανοίγουμε τη στρόφιγγα ροής Προσθέτουμε συνεχώς ρυθμιστικό διάλυμα και συλλέγουμε 6 κλάσματα των 3 ml ανά σωληνάριο (μέχρι τη μαύρη γραμμή) Αφήνουμε να περάσουν άλλα 10 ml ρυθμιστικό (τα πετάμε στο δοχείο) Αρχίζουμε να προσθέτουμε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα/1 Μ KCl Συλλέγουμε 6 κλάσματα των 3 ml (Νο 7 - 12) Ξεπλένουμε με τουλάχιστον 10 ml από το αρχικό ρυθμιστικό (στο δοχείο) Φωτομέτρηση όλων των κλασμάτων: στα 280 nm και στα 260 nm

Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών Προσθέτουμε 4ml διουρίας Αναδεύουμε Επώαση για 30’, RT Φωτομέτρηση στα 550nm Αριθμός σωληναρίου Πρότυπο διάλυμα αλβουμίνης (ml) Ορός (ml) Νερό 1 (τυφλό) - 1,0 2 0,1 0,9 3 0,2 0,8 4 0,5 5 6 7 (άγνωστο) 0,05 0,95 8 (άγνωστο) 0,10 Φυσιολογία Ζώων

Αποτελέσματα-Υπολογισμοί Συγκέντρωση πρωτεϊνών (mg/ml) C (mg/ml) = 1.55 x OD280nm – 0.77 x OD260 nm

Αποτελέσματα-Υπολογισμοί Μαζική απομόνωση : C πρωτεΐνης mg/ml για το τμήμα και την ομάδα σας mg/κλάσμα για Α και Β για το τμήμα και την ομάδα σας Χρωματογραφία σε στήλη : Πίνακας (mg/ml και mg/κλάσμα) Γραφική παράσταση (όπου άξονας χ: αριθμός κλάσματος, άξονας ψ: mg/ml ή mg/κλάσμα) Ποσοτικός προσδιορισμός (αναλυτικά): συνολική πρωτεΐνη ορού (mg/ml) % ανάκτηση ανοσοσφαιρινών (IgG) και % ανάκτηση ολικών πρωτεϊνών - μαζική (τμήμα και ομάδα) - στήλη (ομάδα)