72120 – ביוכימיה של התא מנגנוני קטליזה אנזימתית - כימוטריפסין 72120 – ביוכימיה של התא מנגנוני קטליזה אנזימתית - כימוטריפסין

כימיה אורגנית 0 נוקלאופיל – ריאגנט אשר יוצר קשר על ידי תרומת שני אלקטרוני הקשר. צריך להכיל זוג אלקטרונים בלתי קושרים. אלקטרופיל – ריאגנט אשר נמשך לאלקטרונים, ומקבל את שני אלקטרוני הקשר בתגובה. בדרך כלל נושא מטען או מטען חלקי חיובי. התקפה נוקלאופילית – תגובה שבה נוקלאופיל "תוקף" באמצעות אלקטרוני הקשר את האלקטרופיל. פחמן קרבונילי מהווה אלקטרופיל נפוץ בתגובות ביולוגיות. ( C=O )

אסטרגיות של קטליזה Covalent catalysis– האתר הפעיל מכיל בדרך נוקלאופיל חזק שיוצר קשר קוולנטי זמני עם הסובסטרט. שני השלבים צריכים להיות מהירים יותר מהריאקציה ללא קטליזה.

אסטרגיות של קטליזה Metal ion catalysis– יון המתכת באנזים יכול לפעול בכמה אופנים: ייצוב מטען. יצירת נוקלאופיל חזק יותר. הידוק הקשר בין האנזים והסובסטרט. עיצוב הקשר בין האנזים והסובסטרט.

אסטרגיות של קטליזה General acid/base– האנזים מגלם תפקיד של חומצה או בסיס. בסיס/חומצה ספציפיים – תגובות בהם הבסיס או החומצה בעצמם משתתפים בתגובה (מים). בסיס/חומצה כלליים – הסרה או הוספה של פרוטונים לזירוז התגובה, מסייע בבניית נוקלאופיל חזק. לעתים קרובות His ישחק את תפקיד הבסיס או החומצה.

אסטרגיות של קטליזה Catalysis by approximation– האנזים מאפשר אוריינטציה ספציפית אשר מגבירה את הסיכוי להתרחשות ריאקציה.

כימוטריפסין פרוטאז = אנזים המקטלז ביקוע של קשרים פפטידים, בתגובת הידרוליזה. שייך למשפחת serine proteases. למרות שהידרוליזה של קשר פפטידי היא תהליך מועדף תרמודינמית (G<0), זוהי ריאקציה מאוד איטית בהעדר קטליזטור ((Ea>>0. אנזים מתגבר על מכשולים אלו על ידי כך שמספק סביבה ספציפית (האתר הפעיל) שבה הריאקציה יכולה להתרחש מהר יותר.

התפקיד הביולוגי של כימוטריפסין כימוטריפסין שייך לאנזימי מערכת העיכול. מיוצר ומופרש מהלבלב אל המעי הדק. אנזימי העיכול מיוצרים בלבלב כ zymogens שהם פרקורסורים לא-פעילים שהופכים לאנזימים פעילים רק כאשר מגיעים לאתר הפעולה שלהם במעי הדק.

הביקוע הספציפי בשרשרת הפפטידית של כימוטריפסינוגן גורם לשינוי קונפורמציה שחושף את האתר הפעיל של האנזים. שלוש השרשראות הפפטידיות המרכיבות את האנזים הפעיל מחוברות זו לזו באמצעות קשרים דיסולפידיים. צהוב – קשרים דיסולפידיים

הסובסטרט לכימוטריפסין יש העדפה ברורה לביקוע קשר פפטידי אחרי שייר נפחי והידרופובי. כימוטריפסין מבקע באופן סלקטיבי את הקשר הפפטידי בקצה C’ של חומצות האמינו הארומטיות. כיס הקישור ההידרופובי אחראי לספציפיות של האנזים לסובסטרט.

המבנה של כימוטריפסין אתר הקישור ירוק –כיס הקישור בו יושב השייר הצידי של החומצה האמינית הארומטית אדום – חומצות האמינו המרכיבות את האתר הפעיל. חלבון גלובולרי, מבנה שניוני שרובו בקונפורמצית β. שלוש שרשראות מחוברות בקשרים דיסולפידים.

כימוטריפסין פועל ב-2 שלבים. קטליזה קוולנטית. ניסוי של הרטלי וקילבי משנת 1954: Burst phase כימוטריפסין פועל ב-2 שלבים. קטליזה קוולנטית.

תוצאות ניסוי זה היוו חלק מההוכחות לקיומו של תוצר הביניים אציל-אנזים קוולנטי. הריאקציה מתחילה בקצב מהיר שאחריה התמתנות של הקצב. שלב הקצב המהיר (burst phase) משקף את האצילציה המהירה שעוברות כל מולקולות האנזים (משוחררת כמות ניטרופנול כמעט מקבילה סטוכיומטרית לכמות האנזים) והקצב עבור ערך ה turnover של האנזים מוגבל ע"י שלב הדה-אצילציה האיטי.

מנגנון הפעולה של כימוטריפסין תוצר ביניים קוולנטי - שלב האצילציה (acylation phase) - ביקוע הקשר הפפטידי ויצירת קשר אסטרי בין הפחמן הקרבונילי של הפפטיד והאנזים (יצירת אציל-אנזים קוולנטי שהוא תוצר ביניים זמני). שלב הדה-אצילציה (deacylation phase) – הידרוליזה של הקשר האסטרי ורגנרציה של האנזים.

מנגנון הפעולה של כימוטריפסין - מפורט שלב האצילציה (acylation phase) אתר הקישור ההידרופובי קובע את הספציפיות של כימוטריפסין.

הנוקליאופיל בשלב האצילציה הוא אטום החמצן של Ser195 הנוקליאופיל בשלב האצילציה הוא אטום החמצן של Ser195. ה pKa של ההידרוקסיל של סרין בד"כ גבוה מכדי שהצורון המיונן יהיה נוכח ב pH פיזיולוגי, אולם הסביבה הכימית של Ser195 בכימוטריפסין גורמת להנמכת ה pKa שלו. כיצד? The catalytic triad

The catalytic triad

שלב 1 – הסובסטרט נקשר לאנזים שלב 1 – הסובסטרט נקשר לאנזים. Ser195 מעביר פרוטון ל His57 ומבצע התקפה נוקליאופילית על הפחמן הקרבונילי של הסובסטרט. מתקבל תוצר ביניים טטרהדרלי קצר-חיים שבו יש מטען שלילי על החמצן הקרבונילי של הסובסטרט. מטען זה מיוצב ע"י קשרי מימן ב “oxyanion hole".

שלב 2 – חוסר יציבות של המטען השלילי על החמצן הקרבונילי מוביל לפירוק תוצר הביניים. יצירה מחדש של הקשר הכפול עם הפחמן מחליפה את הקשר בין הפחמן וקבוצת האמינו של הקשר הפפטידי וכך נשבר הקשר הפפטידי. נוצר אציל-אנזים. קבוצת האמינו עוברת פרוטונציה ע"י His57.

שלב 3 – אמין השתחרר מהאנזים.

שלב הדה-אצילציה (deacylation phase) שלב 4 – מולקולת מים נכנסת דרך קשר מימן עם His57. מולקולת המים עוברת דה-פרוטונציה (His57 מקבל פרוטון). יון ההידרוקסיד תוקף את הקשר האסטרי של האציל-אנזים. תוצר ביניים טטרהדרלי נוצר. מטען שלילי על חמצן קרבונילי מיוצב על ידי קשרי מימן ב “oxyanion hole".

שלב 5 – חוסר יציבות מוביל לפירוק תוצר הביניים. Ser195 משתחרר שלב 5 – חוסר יציבות מוביל לפירוק תוצר הביניים. Ser195 משתחרר. His57 עובר דה-פרוטונציה ומעביר פרוטון ל Ser195.

שלב 6 – קומפלקס אנזים-תוצר (EP).

בשלב 7 התוצר משתחרר מהאתר הפעיל כך שהאנזים מוכן שוב לפעולה.

מנגנון הפעולה של כימוטריפסין מדגים עקרונות קטליטיים המצויים בשימוש ע"י אנזימים רבים: Covalent catalysis – האתר הפעיל מכיל קבוצה ריאקטיבית, בד"כ נוקלאופיל חזק, שבמהלך הקטליזה עובר מודיפיקציה קוולנטית זמנית. בכימוטריפסין – יצירת אציל-אנזים. General acid-base catalysis – מולקולה אחרת מ H2O משמשת בתפקיד proton donor/acceptor. בכימוטריפסין - His57 תיפקד כבסיס בשלבים מסוימים וכחומצה בשלבים אחרים במהלך הריאקציה.

שאלה 1: להלן פרוטאזות הדומות לכימוטריפסין. נתונים אתרי הקישור של שתיים מהן, נסו לנחש מה יהיה אופי הסובסטרטים של כל אחת מהן: כימוטריפסין קושר בעיקר חומצות אמינו הידרפוביות גדולות (ארומטיות), כפי שרואים יש לו כיס קישור גדול. טריפסין חותך אחרי שיירים טעונים חיובית (ליזין וארגינין) בעוד אלסטאז חותך אחרי שיירים קטנים.

שאלה 2 תשובה במחקר נעשתה מוטציה ב Asp102 בכימוטריפסין ל Asn והוחלט לבדוק את הפעילות של האנזים המוטנט. מה יהיה ההבדל בערכי Km ו- kcat בין האנזים המוטנט ל-?WT תשובה היות שAsp102 משתתף ב-catalytic triad היכולת של האנזים ליצור נוקלאופיל חזק יותר תקטן, ולכן גם שלב האצילציה וגם שלב הדה-אצילציה יהיו איטיים יותר כך ש kcat יהיה נמוך בהרבה. עם זאת, לא ניתן לקבוע לגבי Km בצורה ודאית היות שאנו לא יודעים איזה מהשלבים יואט בצורה משמעותית יותר.

שאלה 3: הריאגנט Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) מעכב באופן ספציפי כימוטריפסין על ידי קישור קוולנטי ל His57 א. ציינו מדוע המעכב ספציפי עבור כימוטריפסין. ב. הציעו ריאגנט, בהתבסס על מבנה TPCK שעשוי להיות מעכב יעיל של טריפסין. TPCK פתרון: א. TPCK ספציפי לכימוטריפסין היות והטבעת הפנילית של Phe עוברת אינטראקציה יעילה עם כיס הקישור של האתר הפעיל של כימוטריפסין. כך קבוצת הכלורומתיל מוצבת במיקום המאפשר הגבה עם His57 ב. החלפה של שייר הPhe ב TPCK בארגינין או ליזין תיצור ריאגנטים שיהיו ספציפיים לעיכוב טריפסין.

שאלה 4 כאשר כימוטריפסין מפרק סובסטרט מסוים X, לא נמדד שלב burst והריאקציה מתנהגת בצורה לינארית לכל אורכה. מה ההסבר הסביר ביותר? א. כימוטריפסין מפרק את התוצר באסטרטגיה של חומצה ובסיס כלליים ואין תוצרי ביניים בתגובה. ב. הסובסטרט המדובר מתפרק בצורה דומה כמו בניסוי של הרטלי וקילבי אך התוצר אשר אותו "רואים" בניסוי הוא התוצר השני שמשתחרר. ג. שלב יצירת האציל-אנזים הוא שלב קובע המהירות ושלב פירוק האציל-אנזים הוא השלב המהיר. ד. כימוטריפסין אינו מסוגל לפרק את קומפלקס האציל-אנזים במקרה של פירוק סובסטרט X. תשובה ב נכונה מבחינה עקרונית, אך היא מתארת טעות של הנסיין. תשובה ג נותנת הסבר ביולוגי

שאלה 5 איזה משפט הוא הנכון ביותר לגבי השלשה הקטליטית של כימוטריפסין? א. שלושת השיירים משמשים בתגובה כחומצות או בסיסים כלליים. ב. סרין 195 משתתף בתגובה וקושר קוולנטית את השייר של היסטידין 57 ולכן התגובה נחשבת כקטליזה קוולנטית. ג. סרין 195 אשר בדר"כ מהווה נוקלאופיל חלש משמש כנוקלאופיל חזק בריאקציה בכימוטריפסין. ד. אספרטאט 102 משמש גם נוקלאופיל וגם אלקטרופיל בריאקציה. ג