Chirálna separácia v kapilárnej elektroforéze Gábor Benkovics Katedra analytickej chémie Fakulta chemickej a potravinárskej technológie Slovenská Technická Univerzita v Bratislave 17.04.2012

CHIRALITA Vzťah predmetu k svojmu zrkadlovému obrazu

Chiralita na molekulovej úrovni Rovnaké atómové zloženie, rozdielne priestorové usporiadanie Chirálna príroda: D a L cukry, D a L aminokyseliny, interakčné miesta enzýmov

Vlastnosti enantiomérov Rovnaké fyzikálno-chemické vlastnosti v achirálnom prostredí [ okrem optickej otáčavosti (α) ] Prejav rozdielnych vlastností v chirálnom prostredí ( v organizme živočíchov) Príklady: Rozdielne inhibičné aktivity u agrochemikálií: DICLOBUTRAZOL - 4 enantioméry, najvyššiu fungicídnu aktivitu vykazuje (2R,3R) Rozdielna chuť, vôňa, nutričná hodnota u potravín: S-Limonen – citrónová aróma R-Limonen – pomarančová aróma

Rozdielne terapeutické účinky enantiomérov u liečiv Katastrofa Thalidomidu

Metódy na separáciu enantiomérov GC: limitována těkavostí analytov SFC: limitovaná polaritou analytov HPLC: často nízká separační účinnost CE: kombinace vysoké účinnosti GC s univerzálností HPLC výhodná pro separaci jak polárních, tak nepolárních látek Výhody CE: malá spotreba vzorky, rýchla analýza, vysoké rozlíšenie, možnosť analýzy polárnych i nepolárnych látok, malých aj veľkých iónov Nevýhody CE: nižšia reprodukovateľnosť

Kapilárna elektroforéza Teoretické základy Elektroforetická mobilita ν = μ.E Fe = q.E Ff = -6πηrν [m-2V-1s-1] Elektroforetická pohyblivosť (mobilita) je charakteristická pre daný migrujúci ión a pre dané prostredie v ktorom ión sa nachádza.

Elektroosmotický tok Electroosmotic flow - EOF Výhody kapilár s malým priemerom (r<100μm)

EOF - Výhody Analýza aniónov a katiónov v jednom meraní

EOF - Výhody Plochý profil prúdenia – Menšie rozmývanie zón difúziou, úzke píky, vysoké rozlíšenie Príklad: Chirálna analýza hexabarbitalu pomocou CE a HPLC

Inštrumentácia v CE

Inštrumentácia v CE V roku 1967 V súčasnosti

Separácia enantiomérov pomocou CE Enantioméry: rovnaké fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. elektroforetická mobilita) v achirálnom prostredí Chirálne prostredie: rozdielna interakcia s chirálnymi látkami - Interakcia s chirálnym selektorom v separačnom systéme - Priama separácia enantiomérov - Interakcia s chirálnym derivatizačným činidlom pred separačným systémom Nepriama separácia enantiomérov

PRIAMA SEPARÁCIA Prídavok CS do základného elektrolytu Prídavok CS do základného elektrolytu – vytvorenie pseudofázy, ktorá sa voľne pohybuje Malé objemy pufru s CS– možnosť používania veľmi drahých chirálnych selektorov Test enantioselektívnych vlastností nových potenciálnych CS Rýchly screening pomocou rôznych chirálnych selektorov

Chirálne selektory v CE Crown - étery Makrocyklické antibiotiká Glykopeptidy

Cyklodextríny ako chirálne selektory Cyklické oligosacharidy pozostávajúce z glukopyranózových jednotiek, medzi ktorými je (α-1,4) - glykozidová väzba Hydrofóbna dutina – hydrofilný okraj dutiny Veľkosť dutiny je charakteristická pre jednotlivé typy cyklodextrínov ( α-,β- a γ- cyklodextríny)

Tvorba inklúznych komplexov s analytom Inklúzia hydrofóbnej časti molekuly do apolárnej dutiny a súčasné interakcie okrajovými skupinami cyklodextrínu a polárnymi skupinami, ktoré sú blízko k stereogénnemu centru.

Teória chirálnej separácie pomocou cyklodextrínov Δμ – rozdiel mobility enantiomérov (Δμ ≠ 0 – úspešná chirálna separácia) μF – mobilita voľného (nekomplexovaného) analytu K1 a K2 - konštanty stability analyt – CD komplexov [C] - je koncentrácia chirálneho selektoru μC1 a μC2 - elektroforetické pohyblivosti analyt – CD komplexov U CD vo väčšine prípadov platí μC1 =  μC2 K1 ≠  K2 - Rozdielna stabilita analyt – CD komplexov μF ≠ μC - Rozdielna mobilita komplexovaného a nekomplexovaného analytu

Cyklodextrínové deriváty substitúcia okrajových OH skupín zvýšenie rozpustnosti zvýšenie počtu interakčných miest zvýšenie asymetrie u monosubstituovaných derivátov zmena veľkosti a hĺbky CD kavity „tailor made“ deriváty špeciálne syntetizované pre daný analyt ionizovateľné, kladne a záporne nabité CD deriváty

Monosubstituované, katiónové deriváty β-cyklodextrínu PEMEDA- β-CD PEXYDA- β-CD Mono(6-deoxy-6-N,N,N’,N’,N’-pentametyl-etylén-diamónium)- β-cyklodextrin Mono-(6-deoxy-6- N,N,N’,N’,N’-pentametyl-p-xylylén-diamónium)- β-cyklodextrin

Analyty: racemická zmes N-tBOC-aminokyselín N-t(BOC)-Tryptofán N-t(BOC)-Tyrozín N-α-t(BOC)-Arginín

PEMEDA – β - CD CPEMEDA = 1mM pH = 9,5 U = 30 kV T = 25°C

PEXYDA – β - CD CPEXYDA = 1mM pH = 9,5 U = 30 kV T = 25°C

Vplyv koncentrácie chirálneho selektoru (PEMEDA-β-CD) na selektivitu enantioseparácie pri rôznych hodnotách pH

Použitá literatúra: RNDr. Vítězslav Maier, Ph.D., RNDr. Jan Petr, MSc. Joanna Znaleziona, a prof. RNDr. Juraj Ševčík, Ph.D. - KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA V ANALÝZE OPTICKY AKTÍVNYCH LÁTOK Zoltán Juvancz1, Rita Bodáné Kendrovics1, Róbert Iványi2, Lajos Szente2 - The role of cyclodextrins in chiral capillary electrophoresis Wren, S.A.C., Chromatographia 2001, 54, S7-S14 Wren, S. A. C., Rowe, R. C., J. Chromatogr. 1992, 603, 235–241. Jindřich, J.: Habilitační práce, PřF UK Praha, 2005 doc. RNDr. Eva Tesařová, CSc - Chirální chování v přírodě a chirální separace doc. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc – Prednášky z predmetu Analýza optických izomerů David Heiger High performance capillary electrophoresis, An introduction, 2000 Agilent Technologies

Ďakujem za pozornosť !