Μονιμοποιητικά Διαλύματα Μονιμοποίηση Μονιμοποιητικά Διαλύματα

Μονιμοποίηση Η μονιμοποίηση είναι μία ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗ διαδικασία που γίνεται αμέσως μετά τη συλλογή του δείγματος Η μονιμοποίηση είναι μόνιμη και μη αναστρέψιμη κατάσταση Σκοπός της μονιμοποίησης είναι να διατηρήσει στο ακέραιο τη δομή των ιστών για όσο το δυνατό μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Με την εξαίρεση του ιστού από τον οργανισμό, ο μεταβολισμός των κυττάρων σταματάει και ως εκ τούτου ενεργοποιούνται μεταθανάτιες αλλαγές όπως είναι η αυτόλυση και η σήψη

Αποτελέσματα και επίδραση της μονιμοποίησης Η μονιμοποίηση παρεμποδίζει τις ενζυμικές διαδικασίες της αυτόλυσης, καθώς επιτυγχάνεται ταχεία, ομοιόμορφη και πλήρη διείσδυση της μονιμοποιητικής ουσίας στους ιστούς. Διατηρείται η χημική και μικροανατομική σύσταση του ιστού με σκοπό την περαιτέρω ιστοχημική επεξεργασία του. Επιδρά στην ιστοχρώση: Συγκεκριμένα μονιμοποιητικά (π.χ. φορμαλδεΰδη) ενισχύουν τα χρωστικά χαρακτηριστικά του ιστού ιδιαίτερα με τη χρώση της αιματοξυλίνης Σκλήρυνση του ιστού: Η σκλήρυνση του ιστού διευκολύνει την επεξεργασία του. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι οι μαλακοί ιστοί όπως είναι ο εγκέφαλος, το λίπος, κλπ Στερεοποίηση- πήξη του ιστού: Μετατρέπει τα ημίρρευστα συστατικά του κυττάρου σε στερεά (πχ κυτταρόπλασμα)

Αποτελέσματα και επίδραση της μονιμοποίησης Οπτική διαφοροποίηση: Αλλάζει τον βαθμό του δείκτη διάθλασης των διαφορετικών οργανιδίων του κυττάρου με αποτέλεσμα να είναι πιο εύκολο να τα δούμε στο μικροσκόπιο. Το είδος της μονιμοποίησης επιλέγεται πάντα ανάλογα με τον τύπο του προς μελέτη ιστού ή οργάνου και από τις διάφορες ιστικές δομές που περιλαμβάνει ο συγκεκριμένος ιστός ή το όργανο.

Κατηγορίες Μονιμοποιητικών Αλδεΰδες: Περιλαμβάνεται η φορμαλδεύδη και η γλουταραλδεϋδη. Η µονιµοποίηση επιτυγχάνεται με τον σχηματισμό δεσµών με τις πρωτεΐνες του ιστού (κυρίως µε τα κατάλοιπα λυσίνης). Αυτοί οι δεσµοί δεν καταστρέφουν τη δοµή των πρωτεϊνών µε αποτέλεσµα να διατηρείται η αντιγονικότητά τους. Για αυτό το λόγο, αυτά τα μονιμοποιητικά είναι κατάλληλα και για ανοσοιστοχημικές τεχνικές. Άλατα Υδραργύρου: Ο µηχανισµός µε τον οποίο προκαλείται η µονιµοποίηση του ιστού είναι προς το παρόν άγνωστος. Τα πλέον γνωστά µονιµοποιητικά αυτής της κατηγορίας είναι τα B-5 και Zenker's. Αλκοόλες: Περιλαμβάνεται η μεθυλική αλκοόλη (methanol) και η αιθυλική αλκοόλη (ethanol). Η μονιμοποίηση επιτυγχάνεται με αποδιάταξη των πρωτεϊνών με αποτέλεσμα ο ιστός να σκληραίνει και να γίνεται εύθραυστος. Γενικά δεν χρησιμοποιούνται συχνά ως µονιµοποιητικά. Όμως είναι πολύ καλές µονιµοποιητικές ουσίες για κυτταρολογικά επιχρίσµατα (PAP smears) γιατί δρουν ταχύτατα και δίνουν πολύ καλές λεπτομέρειες του πυρήνα.

Κατηγορίες Μονιμοποιητικών Οξειδωτικά: Περιλαμβάνονται τα άλατα του υπερμαγγανικού οξέος (υπερμαγγανικό κάλιο), μονιμοποιητικά του διχρωμίου (∆ιχρωµικό κάλλιο) και το Τετροξείδιο του Οσµίου. Σχηματίζουν δεσµούς µε τις πρωτεΐνες προκαλώντας εκτεταμένη αποδιάταξη αυτών. Πικρικά: περλαμβάνονται μονιμοποιητικά με βάση το πικρικό οξύ. Κύριο μονιμοποιητικό το διάλυμα Bouin's. Ο μηχανισμός δράσης τους είναι άγνωστος. Μονιμοποίηση σε φούρνο μικροκυμάτων: Η ακτινοβολία του MW μονιμοποιεί τον ιστό όταν αυτός είναι εμποτισμένος με φυσιολογικό ορό ή άλλο ισοτονικό διάλυμα (primary fixation). Μονιμοποίηση με απότομη ψύξη: Γίνεται συνήθως με ισοπεντάνιο που ψύχεται με υγρό άζωτο.

Συγκεντρωτικός πίνακας κατηγοριών μονιμοποιητικών υλικών Συγκεντρωτικός πίνακας κατηγοριών μονιμοποιητικών υλικών Αλδεΰδες Φορμαλδεΰδη, Γλουταραλδεύδη Άλατα Υδραργύρου Β-5, Zenker’s Αλκοόλες Μεθανόλη, Αιθανόλη Οξειδωτικά Υπερμαγγανικό Κάλιο, Διχρωμικό Κάλιο, Τετροξείδιο του Οσμίου Πικρικά Διάλυμα Bouin's

Συγκεντρωτικός πίνακας μονιμοποιητικών διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται στην καθημερινή ιστολογική πράξη. Phosphate buffered formalin Formal calcium Formal saline Zinc formalin (unbuffered) Zenker’s fixative Helly’s fixative B-5 fixative Bouin’s solution Hollande’s Gendre’s solution Clarke’s solution Carnoy’s solution Methacarn Alcoholic formalin Formol acetic alcohol Note: Σε καμία περίπτωση δεν αποτελεί πλήρη κατάλογο. Για το κάθε ένα από αυτά υπάρχουν εκατοντάδες τροποποιήσεις. Κάποια είναι εμπορικά διαθέσιμα έτοιμα προς χρήση.

Χαρακτηριστικά παραδείγματα κακής μονιμοποίησης του ιστού Χαρακτηριστικά παραδείγματα κακής μονιμοποίησης του ιστού. Το μονιμοποιητικό διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε και στις δύο περιπτώσεις νεφρικών βιοψιών, είναι η ουδέτερη φορμόλη. Στην δεξιά εικόνα η σωστή μονιμοποίηση διατηρεί την μορφολογία του πυρήνα, του κυτταροπλάσματος της βασικής μεμβράνης και των ορίων των κυττάρων. Στην δεξιά εικόνα η λάθος μονιμοποίηση δεν διατηρεί την μορφολογία των κυττάρων, παρατηρείται συρρίκνωση αυτών με ασαφή όρια. Στα νεφρικά σωληνάρια παρουσιάζονται κενοτόπια, κατακερματισμό των πυρήνων και του κυτταροπλάσματος των κυττάρων. Το νεφρικό σπείραμα είναι συρρικνωμένο.

Φορμαλδεΰδη Δεν υπάρχουν τέλεια μονιμοποιητικά υγρά, η φορμόλη, όμως, εμφανίζει τα περισσότερα πλεονεκτήματα, είναι ένα δοκιμασμένο και με χαμηλό κόστος μονιμοποιητικό μέσο, με εξαίρεση τις ερεθιστικές ιδιότητες των ατμών της. Κοινό μονιμοποιητικό διάλυμα (ρουτίνας) Αντιδρά με τις αμίνες των πρωτεϊνών και τα νουκλεικά οξέα σχηματίζοντας μερικώς αντιστρεπτές γέφυρες μεθυλενίου Η φορμαλδεΰδη διαπερνά καλά τους ιστούς, αλλά εμφανίζει µικρή ταχύτητα µονιµοποίησης. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες έχει την τάση να οξειδώνεται σχηματίζοντας μυρμηκικό οξύ. Η παρουσία πάνω από 10% methanol αποτρέπει την οξείδωση της

Φορμαλδεΰδη Παρουσία αίματος (π.χ. στον ιστό) δημιουργούνται εναποθέσεις φορμόλης (formalin pigment) οι οποίες βάφουν τον ιστό. Στις εικόνες παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγματα εναποθέσεων φορμόλης (βιοψία νεφρού αριστερά και δέρματος δεξιά). Στη ρουτίνα χρησιμοποιούμαι διάλυμα ουδέτερης φορμόλης ή Phosphate buffered formalin

Phosphate buffered formalin Σύσταση 40% φορμαλδεΰδη: 100 ml Απεσταγμένο νερό : 900 ml Sodium dihydrogen phosphate monohydrate: 4 g Disodium hydrogen phosphate anhydrous: 6.5 g Το διάλυμα πρέπει να έχει pH περίπου 6.8 Χρόνος μονιμοποίησης: 12 – 24 ώρες Είναι το πιο διαδεδομένο μονιμοποιητικό στην ιστοπαθολογία, μειώνει το σχηματισμό χρωστικών της φορμόλης. Χρειάζεται επεξεργασία ανάκτησης των ιστικών αντιγόνων προκειμένου να έχουμε επιτυχή ανοσοιστοχημεία.

Διάλυμα φορμόλης ασβεστίου Σύσταση 40% φορμαλδεΰδη: 100 ml Calcium chloride: 10 g Απεσταγμένο νερό : 900 ml Χρόνος μονιμοποίησης 12 – 24 ώρες. Συνίσταται για την μονιμοποίηση των λιπιδίων και φωσφολιπιδίων. Ισοτονικό διάλυμα φορμαλδεΰδης 40% φορμαλδεΰδη : 100 ml χλωριούχο νάτριο (Sodium chloride): 9 g Χρόνος μονιμοποίησης : 12 – 24 ώρες. Είναι ευρέως διαδεδομένο μονιμοποιητικό, εύκολο στην παρασκευή, αλλά δημιουργεί εναποθέσεις φορμόλης.

Formol acetic alcohol ή Μονιμοποιητικό Davidson's ή Hartmann's Σύσταση Ethanol absolute: 85 ml 40% φορμαλδεΰδη : 10 ml Acetic acid glacial: 5 ml Επιτυγχάνεται γρήγορη μονιμοποίηση σε 1 – 6 ώρες. Διατηρεί την μορφολογία των κυττάρων, Αφήνει κατάλοιπα φορμόλης. Καλό μονιμοποιητικό για βιοπτικά υλικά (λεμφαδένες, οστεομυελικές βιοψίες, λίπος). Εναλλακτικά μονιμοποιεί τομές κρυοστάτου. Απαραίτητη προϋπόθεση μετά το πέρας των 6 ωρών ο ιστός μεταφέρεται σε οινόπνευμα 95%.

Γλουταραλδεΰδη Προκαλεί αποδιοργάνωση της α έλικας των πρωτεϊνών και έτσι δεν χρησιμοποιείται για ανοσο-οξειδωτικές χρώσεις. Το διάλυμα της γλουταραλδεύδης πρέπει να περιέχει μονομερή ή ολιγομερή για πιο γρήγορη ταχύτητα µονιµοποίησης. Δίνει πολύ καλές πληροφορίες για το κυτταρόπλασµα και τον πυρήνα. Αυτές οι ιδιότητες καθιστούν τη γλουταραλδεΰδη κατάλληλη για παρατήρηση ιστών µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Στην ρουτίνα χρησιμοποιούμε διάλυμα Glutaraldehyde 2% in 0.1M Phosphate Buffer, pH 7.4

Η γλουταραλδεΰδη πρέπει να χρησιµοποιείται κρύα και µε κατάλληλο pH Δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί για διάστηµα µεγαλύτερο των 3 µηνών από την παρασκευή της. Ο ιστός πρέπει να είναι φρέσκος και πάχους µικρότερο από 1 mm, έτσι ώστε να επιταχυνθεί η µονιµοποίηση.

Άλατα Υδραργύρου Ο µηχανισµός µε τον οποίο προκαλείται η µονιµοποίηση του ιστού είναι προς το παρόν άγνωστος. Τα πλέον γνωστά µονιµοποιητικά αυτής της κατηγορίας είναι τα B-5 και Zenker's. Προσδίδουν σκληρότητα στον ιστό, έχουν µεγάλη ταχύτητα µονιµοποίησης και δίνουν πολύ καλή λεπτομέρεια του πυρήνα. Χρησιµοποιούνται συνήθως για τη µονιµοποίηση του αιµοποιητικού και δικτυοενδοθηλιακού ιστού (λέµφος, σπλήνα, θύµος, νωτιαίος µυελός). Ο υδράργυρος επικάθεται στον ιστό και φαίνεται στο μικροσκόπιο σαν µαύρες εναποθέσεις που εµποδίζουν την µικροσκοπική παρατήρηση. Γιαυτό χρειάζεται να απομακρυνθεί με επεξεργασία πριν από τη χρώση των τοµών.

Zenker’s fixative Σύσταση Απεσταγμένο νερό: 950 ml χλωριούχος υδραργύρος (Mercuric chloride): 50 g διχρωμικό κάλιο (Potassium dichromate): 25 g οξικό οξύ (Glacial acetic acid): 50 ml Χρόνος μονιμοποίησης: 4 – 24 ώρες Δίνει καλή μορφολογία του πυρήνα.Η παρουσία του οξικού οξέος λύει τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Είναι κατάλληλο για ιστοχημικές χρώσεις όπως είναι οι τριχρωμικές, PTAH κλπ. Αφήνει εναποθέσεις υδραργύρου στον ιστό που πρέπει να απομακρύνονται με την ανάλογη επεξεργασία. Μετά το πέρας της μονιμοποίησης είναι απαραίτητη προϋπόθεση, ο ιστός να μεταφέρεται σε 70% αιθανόλη.

Μονιμοποιητικό διάλυμα Β-5 Stock solution Mercuric chloride: 12 g Sodium acetate anhydrous: 2.5 g Distilled water: 200 ml Working solution B-5 stock solution: 20 ml 40% formaldehyde: 2 ml Διάρκεια μονιμοποίησης 4 – 8 ώρες. Είναι κατάλληλο για την μονιμοποίηση οστεομυελικών βιοψιών, λεμφαδένων ιδιαίτερα όταν υπάρχει υποψία λεμφώματος ή λευχαιμίας. Δίνει εξαίρετη μορφολογία πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Είναι κατάλληλο για ανοσοιστοχημικές χρώσεις. Μετά το πέρας της μονιμοποίησης ο ιστός πρέπει να μεταφέρεται σε 70% αιθανόλη.

Αλκοόλες Η µεθανόλη και η αιθανόλη δεν χρησιμοποιούνται συχνά ως µονιµοποιητικά, γιατί αποδιατάσσουν τις πρωτεΐνες, σκληραίνουν και καθιστούν εύθραυστους τους ιστούς. Είναι όµως πολύ καλές µονιµοποιητικές ουσίες για κυτταρολογικά επιχρίσµατα (PAP smears) γιατί δρουν ταχύτατα και δίνουν πολύ καλές λεπτομέρειες για τον πυρήνα. Methacarn Σύσταση Methanol absolute: 60 ml Chloroform: 30 ml Acetic acid glacial: 10 ml Χρόνος μονιμοποίησης 1 – 4 ώρες. Γρήγορο μονιμοποιητικό, δίνει πολύ καλή μορφολογία, λύει τα ερυθρά αιμοσφαίρια, διατηρεί το γλυκογόνο και διαλύει το λίπος. Μπορεί να προσδώσει ιδιαίτερη σκληρότητα και συρρίκνωση του ιστού.

Πικρικά (Bouin's solution) Ο µηχανισµός δράσης του είναι άγνωστος, αλλά όπως και τα μονιμοποιητικά που περιέχουν άλατα υδραργύρου, δίνει πολύ καλές λεπτοµέρειες για τον πυρήνα χωρίς να προκαλεί σκληρότητα του ιστού. Χρησιµοποιείται για τη µονιµοποίηση ιστών και οργάνων όπως νεφρός καθώς και ενδοκρινείς αδένες. Μερικές φορές συνιστάται για βιοψίες του γαστρεντερικού συστήματος, εμβρύων κλπ. Το πικρικό οξύ είναι εκρηκτικό σε ξηρή µορφή Σύσταση Υδατικό Κεκορεσμένο Πικρικό οξύ (2.1%): 750 ml 40% φορμαλδεΰδη: 250 ml Οξικό οξύ: 50 ml Χρόνος μονιμοποίησης: 4 – 18 hours

Bouin’s solution Προτεινόμενες Εφαρμογές Δίνει πολύ καλά αποτελέσματα σε ιστούς που πρόκειται να βαφούν με τρίχρωμες χρωστικές. Διατηρεί το γλυκογόνο, λύει συνήθως τα ερυθροκύτταρα. Βάφει τον ιστό φωτεινό κίτρινο εξαιτίας του πικρικού οξέως (εικόνα).Το επιπλέον πικρικό οξύ πρέπει να φύγει από τον ιστό με παρατεταμένη πλύση με νερό βρύσης. Η παρουσία του πικρικού οξέως μπορεί να αφαιρέσει από τον ιστό εναποθέσεις ασβεστίου και σιδήρου. Μετά το πέρας της μονιμοποίησης ο ιστός μεταφέρεται σε 70% αιθανόλη.

Παράγοντες που επηρεάζουν την µονιµοποίηση Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν τη µονιµοποίηση είναι:  pH Η  καλύτερη µονιµοποίηση γίνεται σε ουδέτερο pH (6 – 8). Υποξία του ιστού προκαλεί πτώση του pH, για αυτό θα πρέπει να γίνεται ρύθµιση του µονιµοποιητικού έτσι ώστε να αποφεύγεται το όξινο περιβάλλον. Τα κυριότερα ρυθµιστικά είναι τα phosphate, bicarbonate, cacodylate, και veronal. Η εµπορική φορµαλδεΰδη είναι ρυθµισµένη µε φωσφορικά άλατα σε pH 7. ∆ιαπερατότητα (Φορµόλη, αλκοόλες>υπερµαγγανικά> φορµαλδεΰδη)

Παράγοντες που επηρεάζουν την µονιµοποίηση Ο όγκος µονιµοποιητικού προς ιστό Για καλύτερη μονιμοποίηση και καλύτερα αποτελέσματα πρέπει να τηρείται η αναλογία 10 όγκων µονιµοποιητή προς 1 όγκο ιστού (10:1). Η θερµοκρασία Αύξηση της θερµοκρασίας (σε βαθµό που να µη καταστραφεί ο ιστός), αυξάνει τη ταχύτητα µονιµοποίησης. Η συγκέντρωση Η συγκέντρωση του µονιµοποιητή πρέπει να είναι όσο το δυνατόν µικρότερη (Formalin: 10%, Glutaraldehyde: 0.25%-4%) για οικονοµικούς κυρίως λόγους, αλλά και για αποφυγή αλλοιώσεων του ιστού.

Παράγοντες που επηρεάζουν την µονιµοποίηση Το Xρονικό διάστηµα που μεσολαβεί από την αφαίρεση του ιστού µέχρι την µονιµοποίηση Σηµαντικές αλλοιώσεις θα προκληθούν αν ο ιστός αφεθεί για αρκετό χρόνο εκτός μονιμοποιητικού υλικού και θα ξηραθεί. Ο προς εξέταση ιστός, µόλις συλλεχθεί πρέπει απαραίτητα να τοποθετηθεί στο µονιµοποιητικό όσο το δυνατό ταχύτερα.