Biologija vektora i patogeneza arbovirusa Prof. Dr. Miroslav Valčić Fakultet veterinarske medicine Univerzitet u Beogradu

Arbovirusi Velika grupa virusa različitih bioloških karakteristika Zajednička osobina – prenošenje vektorima Artropodama Nekada se i umnožavaju u vektorima Virusi koji su paraziti artropoda? Arthropod-borne viruses

Arbovirusi- vektori Klasa Insecta – red Diptera Culicoidae

Arbovirusi - vektori Phlebotominae (peščane mušice) Žive blizu vode i u polusuvim mestima

Arbovirusi - vektori Ceratopogonidae

Arbovirusi - vektori Krpelji potkase Acari (klasa Arachnida) Argasidae – meki krpelji Rhipicephalus

Arbovirusi - vektori Meki krpelji - Argasidae

Arbovirusi - vektori Tvrdi krpelji – Ixodidae Dermacentor

Arbovirusi Za razliku od ostalih virusa, arbovirusi se šire horizontalno preko vektora Ostali virusi se prenose direktnim ili indirektnom kontaktom među kičmenjacima Razlika ima posledice po epizootiologiju, evoluciju i kontrolu arbovirusnih infekcija Preko 500 virusa Togavirusi, flavivirusi, bunyavirusi, reovirusi i rabdovirusi (svi su RNK virusi) Velika sposobnost RNK molekula da se adaptira Alternativni mehanizmi replikacije i maturacije DNK - Asfavirusi

Arbovirusi Arbovirusi ljudi Veterinarska medicina Febrilna oboljenja Encefalitisi Hemoragična oboljenja Veterinarska medicina Veća lepeza simptoma Uopšteno – encefalitisi, hemoragični sindrom

Arbovirusi Virusi koji izazivaju najteže simptome Krpelji Toga, alfavirusi, flavivirusi, bunyavirusi Prvi je opisan virus izazivač žute groznice ljudi Još uvek u Africi i Južnoj Americi Denga, Ross River, Venecuelanski encefalitis, Rift Krpelji Najčešće encefalitisi Povremene epizootije i epidemije Stalni oprez i istraživaje mera kontrole i suzbijanja

Transmisija arbovirusa vektorima Neki virusi inficiraju samo primate Žuta groznica, denga Primati (i ljudi) Dva ciklusa: primati i vektori (Aedes) Kompleksniji ciklus Alfavirusi Različiti epidemijski i epizootijski ciklusi Enzootijski Mutacije virusa – epizootije i epdemije Visoke koncentracije mutiranog virusa u velikim životinjama (konji)

Transmisija arbovirusa vektorima Transmisija krpeljima je složenija Sezonski životni ciklus Različiti domaćini za različite razvojne forme krpelja Flavivirus Haemaphysalis krpelj-sisari Trans-stadijumski prenos u krpeljima (amplifikacija) Majmuni uvećaju koncentraciju virusa u prirodi i inficiraju vektore Goveda se zaraze na paši Na povratku u selo – epidemija ljudi preko inficiranih nimfi krpelja

Životni ciklus vektora Komarci su najznačajniji Kompleksni životni ciklus Posle embrionalnog razvoja polažu se jaja Četiri larvena stadijuma u vodi (kod nekih edesa postoji dijapauza) Samo u zaklonjenim vodama (bez talasa i vetra) Dišu neposredno ispod površine vode Mansonia je izuzetak Četvrti stadijum - pupa

Životni ciklus vektora Vreme razvoja Zavisi od vrste, temperature, raspoložive hrane Nekoliko dana do nekoliko nedelja Tokom faze pupe – metamorfoza Od vodene ka fazi odraslog insekta Razara se kutikula Mužjaci ranije sazrevaju

Životni ciklus vektora Ženke se najčešće jednom oplode Mužjaci obično žive jednu nedelju Dužina života ženki varira U tropima – jedna nedelja Kontinentalna klima – mesecima Po nekada - hibernacija Distribucija je nekada mala (0.5 km, Aedes) Kod nekih vrsta i desetine kilometara

Životni ciklus vektora Kontinentalna klima – oplođenje je sezonsko (leto) Oplođene ženke hiberniraju na račun masnih naslaga Neke vrste prežive u vodi Druge vrste – slično Jaja, larva, pupa i odrasli oblik Culicoides i peščane mušice Vodena i poluvodena faza Larve se ukopaju u supstrat Meseci i godine za razvoj Slabi letači – lokalne kocentracije i lokalizovane epizootije

Životni ciklus vektora Neki insekti mogu da prevale desetine kilometara Vetar Krpelji: Argasidae (meki krpelji) i Ixodidae (čvrsti krpelji) Argasidae – sesilni ektoparaziti Ixodidae – ektoparaziti koji menjaju lokacije Za razliku od insekata: velika varijabilnost u odnosu na vrstu – domaćina Egzofilni (otvorena staništa, šume...) i nidalni (blizu domaćina) Svi krpelji su terestralni Jaja, larva, nimfa i odrasli oblik

Životni ciklus vektora Ixodidni krpelji ležu hiljade jaja odjednom Argasidni – u više navrata Iz jaja izlaze larve (6 nogu) Preko trave se hvataju za domaćina – životinje Usledi 1-5 stadijuma nimfe sa osam nogu

Životni ciklus vektora Odrasli oblik nastaje posle preobražaja – sparivanje Svi stadijumi i oba pola se hrane krvlju domaćina Nekoliko stotina mikrolitra, povećanje tela oko 200 puta Argaside se hrane brzo – minuti Ixodide – sporo, danima i nedeljama

Životni ciklus vektora Transformacija u odraslog oblika (molting) se odvija najčešće u prirodi, bez životinje – domaćina Neki krpelji imaju samo jednog domaćina Sve faze razvoja i hranjenje Nekada dva ili više domaćina – kičmenjaka Neki krpelji prežive i do 16 godina

Genotrofni ciklus vektora Put od momenta traženja domaćina (hrane) do poleganja jaja Genotrofni ciklus je kritičan za transmisiju mikroba Za ovogenezu je neophodan obrok krvi – kapljica Često je potrebno nekoliko hranjenja (Culex, Aedes) Traženje domaćina Većina se hrani tokom jutra i u sumrak Senzori za CO2, telesne mirise, temperatura tela

Genotrofni ciklus vektora Posle hranjenja – digestija i formiranje jaja Inhibicija traženja domaćina Većina vrsta komaraca pokazuje specifičnost za vrstu-domaćina Nepoznat mehanizam Brojne vrste se hrane na sisarima i pticama Neki na reptilima, vodozemcima... Potpuni obrok za manje od 10 minuta Često se obrok prekida usled reakcije životinje

Genotrofni ciklus vektora Solenofagni vektori (komarci, mušice) Ubod rilice (proboscis) u krvni sud Formiranje kanala kroz dermis Ubacivanje salive u perivaskularno tkivo Lubrikacija (podmazivanje), alergeni, enzimi, antikoagulansi, vazodilatacija Slični mehanizmi i kod krpelja, peščanih mušica ... Depozicija virusa van krvnih sudova Telmofagni vektori (krpelji, peščane mušice) Hrane se na krvi iz napravljenog jezerceta Kap krvi – nekoliko puta veća zapremina od samog vektora

Genotrofni ciklus vektora Obrok krvi (kap) dolazi u srednje crevo Manji deo u torakalni divertikulum i torakalno srednje crevo Kada se uzastopno uzimaju manji obroci – veća mogućnost prenošenja arbovirusa Iksodidni krpelji su na domaćinu danima i nedeljama Luče se antikoagulansi, vazodilatatori, imunosupresori, antihistaminici, “lepak” za rilicu ... Uvećavanje zapremine krpelja za preko 100 puta Argaside se zadržavaju na domaćinu vrlo kratko

Anatomija komarca BL – bazalna membrana (lamina) C – kardijačno srednje crevo DD – dorzalni divertikulum F – prednje crevo IF – intususceptum creva L – lumen M – srednje crevo ME – epitel srednjeg creva MV – mikrovili srednjeg creva SG – pljuvačne žlezde VD – ventralni divertikulum

Genotrofni ciklus vektora Varenje obroka – kapi krvi Faringealna pumpa-prednje crevo-kardija Prednji kraj torakalnog srednjeg creva-bulbulus (abdominalno srednje crevo tj. stomak) Zadnji deo srednjeg creva – pilorus – zadnje crevo Epitelne ćelije srednjeg creva-bazalna membrana-mišići Ćelije postanu pljosnate kada se stomak napuni Digestija krvi u peharastim ćelijama srednjeg creva Enzimi: tripsin, himotripsin, aninopeptidaze, esteraze, lipaze Završava se za nekoliko dana

Genotrofni ciklus vektora Prihvatanje arbovirusa za epitel srednjeg creva ubrzo posle uvećanja kao posledica unosa obroka (kapi krvi) Aktivnost enzima ne utiče na prihvatanje virusa Hitinozna membrana obavija kapljicu krvi (12 sati) Ako ima više obroka (kapi krvi) – druga kap obavija prvu Razvoj jaja u vektoru - ovipozicija

Genotrofni ciklus vektora Razvoj jaja u vektoru – ovipozicija Posle uzimanja obroka (kap krvi) Vitelogeneza – sinteza žumanca iz aminokiselina iz kapi krvi Molekuli vitelogenina iz hemolimfe uzazi u oocite Spermatozoidi iz spermateke oplode oocite Polaganje jaja na mirna vlažna mesta 50 do 500 Posle polaganja jaja vektor započinje novi genotrofni ciklus Traži domaćina za obrok krvi

Prijemčivost artropoda na arboviruse Kompetencija vektora – kombinacija efekata fizioloških i ekoloških faktora Vektora , domaćina, virusa i uslova spoljašnje sredine Prijemčivost vektora nije jedini uslov ali je kritičan Domaćini vektora – životinje, dužna života vektora Sposobnost vektora da prenese bolest zavisi od genetskih i ne-genetskih faktora

Prijemčivost artropoda na arboviruse Genetski faktori Prijemčivost epitelnih ćelija srednjeg creva na viruse Bluetongue (Culicoides variipennis) – prijemčivost za oralnu infekciju West Nile (Culex) Genetski faktori virusa Različiti serotipovi BT pokazuju različitu virulenciju za Culicoides Vektori mogu da pasiraju vakcinalne sojeve virusa! Tokom evolucije arbovirusi su se adaptirali na vektore i na njihove domaćine (životinje) Značaj ekoloških faktora Alopatski arbovirusi – koji ne cirkulišu samo na lokaciji vektora Slučajna preadaptacija virusa na nove vektore igra ulogu

Oralna infekcija vektora Biološki vektori – replikacija arbovirusa u vektorima Prvo u alimentarnom traktu epitel srednjeg creva (toraks, abdomen, posteriorno srednje crevo) Unošenje virusa u hemokelu skraćuje inkubaciono vreme U kapi krvi, eritrociti su u sredini a serum periferno Izloženost epitelnih ćelija srednjeg creva vektora virusu Virusi kolonizuju epitelne ćelije creva za nekoliko minuta Proteinski receptoia na virusima Uloga proteolitičkih enzima u virulenciji – lakše prihvatanje virusa za ćelije Digestija kod krpelja se razlikuje – heterofagi Digestija kapi krvi je intracelularna

Replikacija i diseminacija arbovirusa Spoljašnji inkubacioni period – vreme od uzimanja obroka (kap krvi) do transmisije arbovirusa Faza eklipse – pad koncentracije virusa do replikacije (1-4 dana) Količina virusa, vrsta vektora, temperatura Uticaj enzima i ulazak virusa u ćelije epitela srednjeg creva Replikacija i distribucija virusa u ćelijama značajno varira Abdominalni, torakalni deo srednjeg creva Diseminacija hemolimfom Neki virusi i putem nervnih struktura Bazalna opna oko većine organa vektora Masno tkivo, epidermis, pljuvačne žlezde Dinamička interakcija prilikom prodora virusa u tkiva vektora Iz hemokele virusi odlaze u organe - tropizam Rift – masno tkivo, pljuvačne žlezde, epidermis, nervne strukture, endokrine strukture

Replikacija i diseminacija arbovirusa Kod krpelja virusi su u hematocitima Ishrana pojačava replikaciju i transmisiju Stimulacija proliferacije pljuvačnih žlezda i reproduktivnog trakta Pojava virusa u pljuvačci Rabdovirus (vezikularni stomatitis) 3 dana Flavi, bunya i orbivirusi - duže Prolazak kroz lam. basale u pljuvačnim žlezdama Pupljenje virusa na različitim površinama ćelija acinusa pljuvačne žlezde Apikalno, bazalno, citoplazmatske vezikule Adaptacija virusa na različite vektore i maksimum trasmisije

Replikacija i diseminacija arbovirusa Titri arbovirusa dostižu maksimum posle nekoliko do nedelju dana Pad koncentracije – antivirusni protein u ćelijama koji blokira RNK sintezu Kod iksodidnih krpelja Svi oblici se hrane na istom domaćinu (larva, nimfa, odrasli) Trans-stadijumski prenos virusa Promene u histololitičkim enzimima tokom metamorfoze utiču na viruse Važan uticaj hematocita

Replikacija i diseminacija arbovirusa Horizontalna transmisija arbovirusa Salivacija tokom hranjenja vektora Koncentracije virusa u salivi (105 infektivnih čestica u nekoliko μl salive) Period u odnosu na spoljašnju inkubaciju Količina krvi Vrsta virusa Vrsta vektora Posle nekoliko nedelja, koncentracije opadaju Depozicija virusa u telu životinje je ekstravaskularno Neobičan horizontalni način transmisije je tokom hranjenja dva ili više krpelja na istoj životinji Ne-viremična životinja može da sa jednog krpelja prenese virus na drugi Obezbeđivanje preživljavanja domaćina uz istovremenu transmisiju virusa

Replikacija i diseminacija arbovirusa Barijere infekcije i virusne diseminacije u vektoru Variraju u odnosu na vrstu vektora, virus, temperaturu Srednje crevo – barijera zavisi od doze virusa Ne-postojanje receptora na epitelnim ćelijama srednjeg creva Sposobnost vektora da moduliraju replikaciju virusa u ćelijama Kod nekih vektora nema diseminacije u pljuvačne žlezde Zavisi od doze Značajna uloga bazalne membrane (debljina) Sprečavanje replikacije virusa u acinarnim ćelijama pljuvačnih žlezda Redukcija titra virusa u pljuvačnim žlezdama

Transmisija arbovirusa Mehanični prenos arbovirusa Neki ne-arbovirusi zavise od mehaničke tramsmisije Mehanička kontaminacija rilice vektora (insekta ili krpelja) Miksoma virus (kunići) Avipoks virus Infektivna anemija konja (Tabanidae) Klacična kuga svinja (Tabanidae) Ovaj način nije od epiziootiološkog značaja za održavanje infektivnog ciklusa u prirodi Može da doprinese intenzitetu epizootije Potencijal zavisi od otpornosti virusa i njegovog titra u krvi kičmenjaka na kojima se hrani

Transmisija arbovirusa Vertikalni (transovarijalni) prenos arbovirusa Veoma rasprostranjen u prirodi – insekti su domaćini za viruse? Krpelji, peščane mušice, komarci Bunya, rabdo, alfa i reovirusi Penetracija arbovirusa u ovarijum putem hemolimfe Infekcija epitela folikula - Infekcija oocista pre formiranja horiona Transovarijalni prenos posle drugog obroka vektora Embrioni komaraca štite viruse čak 19 meseci – preživljavanje virusa u prirodi Mogućnost prenosa zavisi od vrste virusa i vektora Nekada 11%, a nekada i do 95% Vertikalna transmisija je od manjeg značaja Ako je manje od 100% vertikalne transmisije – horizontalni način mora da se poveća Krpelji imaju nizak nivo prenosa ali postoji ne-viremični vertikalni prenos Amplifikacija virusa Održavanje ciklusa transmisije virusa u prirodi

Transmisija arbovirusa Krpelji imaju nizak nivo transmisije Postoji ne-viremični način transmisije na nekoliko generacija Amplifikacija virusa Održavanje ciklusa tramsmisije u prirodi Izuzetak su virusi koji inficiraju germinalne ćelije vektora Veneralni i trans-seksualni način transmisije Kada se jaja inficiraju pre ovipozicije Afrička kuga svinja (Ornithodoros moubata)

Spoljašnji faktori koji utiču na prenos virusa putem vektora Titar virusa u obroku krvi Postoji kritičan-granični titar koji zavisi od virusa i vektora Niski granični titar je pokazatelj adaptacije virusa i vektora Temperatura utiče na prijemčivost vektora Razvoja larve i spoljašnje temperatura odraslih Obrnuta proporcija temperature u odnosu na potrebno vreme transmisije Postoji “nulta” temperatura ispod koje se arbovirusi ne razmnožavaju Ostaju vijabilni – preživljavaju zimu Kod nekih postoji pozitivna korelacija stepena infekcije i temperature (Rift – Culex) Temperatura razvoja larve utiče na prijemčivost odraslih vektora Temperatura utiče na transovarijalni prenos – različito u odnosu na vrstu vektora Sa globalnim zagrevanjem epizootije mogu da se očekuju zbog razlika u replikaciji i diseminaciji virusa u vektorima i usled razlika u mortalitetu vektora Prisustvo antitela i komplementa smanjuje titar virusa u kapi krvi “Gladovanje” u stadijumu larve – efikasniji vektori arbovirusa

Efekti transmisije na evoluciju virusa Značajna genetska stabilnost arbovirusa tokom ciklusa transmisije Neki virusi vrlo brzo menjaju genetski sastav Arbovirusi sto puta sporije evoluiraju u odnosu na ostale RNK viruse Stabilnost nije posledica različitih frekvenci mutacija Brzina evolucije je ograničena usled većeg broja domaćina (kičmenjak-vektor) Striktna selekcija genetske osnove koja omogućava replikaciju u oba domaćina Veća mogućnost izmena tokom replikacije u vektorima Perzistencija kod oralno i transovarijalno inficiranih vektora (mutacije, rekombinacije, reasortiranje) Rift, Bluetongue Reasortiranje naročito kod krpelja Duži životni vek, mogućnost zaražavanja sa dva soje virusa istovremeno

Efekti transmisije na evoluciju virusa Raznolikost i evolucija vektora doprinosi ko-evoluciji arbovirusa zajedno sa vektorima Naročito komarci Prebacivanje na drugu vrstu vektora Mobilnost životinja-domaćina arbovirusa kao faktor diverzifikacije virusa Vektori su više vezani za lokaciju

Virulencija arbovirusa Efekat na kičmenjake Encefalitisi (konjski – zapadni, istočni, Venecuelanski...) Hepatitisi (Rift) Hemoragični sindrom (Denga, žuta groznica) Najteži simptomi kod vrste – domaćina koja ne učestvuje u ciklusa održavnja virusa u prirodi Ne može da se predvidi prijemčivost i način na koje arbovirusi utiču na kičmenjake Efekat na vektore

Virulencija arbovirusa Efekat na vektore Skraćenje života (Rift) za Culex Smanjenje sposobnosti ishrane Povećanje mortaliteta odraslih i nimfa (Afrička kuga svinja – Ornithodoros) Odlaganje razvoja larve i povećanje mortaliteta larve (Rift) Flavivirusi nemaju nikakav poznati efekat na vektore (insekte i krpelje) Infekcija vektora oralnim putem (prirodni put) ima jači efekat Transovarijalno inficirani vektori su otporni na superinfekciju oralnim putem! Cotopatogeni efekat na tkiva vektora (pljuvačna žlezda, srednje crevo)

Evolucija virulencije arbovirusa Komensalizam je cilj evolucije Atenuisanje parazita i rezistencija domaćina U slučaju virusa ne mora da bude tako Virusi se selektuju individualno Ne poseduju grupne karakteristike Virus miksomatoze – selekcija populacije Heterogenost unutar populacije može da utiče na selekciju grupe Za selekciju je bolja heterogenost između populacija Heterogenost arbovirusa je izraženija kod kičmenjaka Mogućnost superinfekcije ubodom različitih jedinki vektora

Evolucija virulencije arbovirusa Drastična razlika evolucije arbovirusa u kičmenjacima i vektorima Artropodi prenose viruse samo ako su mobilni i u kontaktu sa kičmenjacima (hranom) Grupna selekcija ima značajan uticaj na virulenciju u odnosu na vektore Relativno mala oštećenja tkiva vektora Kod vektora postoji tendencija nastanka rezistencije na arboviruse U vektorima se dešava individualna selekcija u cilju povećavanja virulencije tokom epizootija Veliki broj prijemčivih kičmenjaka i kratkom vremenu - kompeticija Najjača grupna selekcija u smislu atenuisanja je kod vertikalne transmisije u vektorima

Evolucija virulencije arbovirusa Visok nivo replikacije i patogenost – prednost arbovirusa u kičmenjacima Mobilnost nije uslov za transmisiju arbovirusa Grupna i individualna selekcija je poželjna Visoki titrovi u telu kičmenjaka – infekcija vektora Pireksija pogoduje transmisiji – privlači vektore Kao i emisija CO2 Smanjena aktivnost tokom izraženih simptoma pogoduje vektorima (nema mehaničke odbrane) Izuzetak su krpelji Selektivni pritisak u cilju smanjenja virulencije Ne-viremična transmisija Krpelji zavise od mobilnosti domaćina

Evolucija virulencije arbovirusa U slučaju nezavisne evolucije oba domaćina evolucija arbovirusa Smanjenje virulencije za vektore Povećanje virulencije za kičmenjake Ograničavanje adaptacije usled čestog menjanja domaćina Izostanak potpunih i svih evolucionih sila Replikacija u vektorima suprimira evoluciju virulencije za kičmenjake