Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov aaa Univerzita Pavla Jozefa Šafárika Katedra biochémie Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mgr. Kamil Tóth …Danišovce 2006 Yellowstone 1969...

●biokatalyzátory chemických reakcií aaa Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Enzýmy ●biokatalyzátory chemických reakcií ●enzýmy proteíny ●metabolické premeny urýchľujú ~ 106 x ●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek. ●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK

●ich štruktúra je tvorená: Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●ich štruktúra je tvorená: kofaktor apoenzým ●aktívne miesto – oblasť katalýzy ●evolúcia – selekcia katalytických skupín ●vysoká špecificita ”key and lock” ●prevaha nekovalentných interakcií ●dynamické štruktúry

●proteosyntetický aparát... ●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Kde sa enzýmy vyskytujú? ... všade tam, kde prebieha život ●metabolické dráhy ●imunitný systém ●proteosyntetický aparát... ●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov ●niektoré organizmy sa prispôsobili extrémnym podmienkam...

Extrémofily Acidofily Barofily Halofily Psychrofily (Mezofily) Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Termofily Psychrofily Barofily Acidofily Halofily (Mezofily) 50-105°C 25-40°C -10 až 20°C 1-700 atmosfér pH 1-5 >2M soľ Extrémofily termofily 50-80°C hypertermofily >80 °C ● odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť „dynamická povaha termostability“

●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov NADH oxidáza z Thermus thermophilus kooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth, Nemecko ●50 kDa homodimér ●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér ●NADH dehydrogenáza ●pI 9,26 ●hypertermofil Topt.=82°C ●neznáma fyziologická funkcia

NADH oxidáza je flavoproteín Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov NADH oxidáza je flavoproteín ●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát ●až  65% flavoproteínov viaže FAD ako kofaktor Biologická všestrannosť ●Citrátový cyklus ●oprava poškodených reťazcov DNA ●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká ●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek ●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín

flavínmononukletid (FMN) adenozínmonofosfát (AMP) Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Štruktúra FAD flavínmononukletid (FMN) adenozínmonofosfát (AMP) adenozín D-ribitol ribolflavín izoalloxazín  flavín flavínadenindinukleotid (FAD)

●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Chinón Semichinón Hydrochinón ●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém „Motýlí ohyb“ zbalená forma rozbalená forma

●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Ciele práce: A ●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy B ●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov ●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti ●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych miestach

●biotechnologický priemysel Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Význam: ●základný výskum ●biotechnologický priemysel

? ●priama interakcia s proteínom ●cytozol 300mg proteínov/ml Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy i) zásahom do primárnej sekvencie – bodové mutácie ii) pôsobením externe modulovaných podmienok soli Hofmeisterovej série Na+, Gdm+, NH4+, Li+, K+ ,Cs+ ...ako je to in vivo ? ●priama interakcia s proteínom ●nepriama s molekulami H2O ●cytozol 300mg proteínov/ml ●existencia voľnej H2O?

●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát ●v ~ aktivita enzýmu Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov KM,NADH KM,FMN Mechanizmus pôsobenia ●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát rovnica Michaelis-Mentenovej ●v ~ aktivita enzýmu

●pozitívne nabité aktívne miesto ●nešpecifická aktivácia Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●pozitívne nabité aktívne miesto ●nešpecifická aktivácia ●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta ●nízka koncetrácia solí elektrostatické interakcie ●vysoká koncetrácia solí Hofmeisterov efekt

●charakteristika interakcie enzým-substrát Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH ●pre 2M soli ●charakteristika interakcie enzým-substrát ●konformačná bariéra K+  Na+  Cs+ > NH4+ > Li+ >> Gdm+

●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát ●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií ●chaotrópne katióny znižujú afinitu ●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru ●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu

●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach ●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD ●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2 ●gyračný polomer: Rg v Å

●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank) Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Databáza flavoproteínov ●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank) ●55 ortológov ●100 kofaktorov ●priemerné rozlíšenie ~ 2.06 Å 46% α/β štruktúra 98% oxidoreduktázy

● kritérium rozlíšenia: < 2Å ● 24 flavoproteínov Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov ● kritérium rozlíšenia: < 2Å ● 24 flavoproteínov ● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach sila interakcie vodíkovej väzby: izoalloxazín < pyrofosfát ~ adenozín < ribityl

Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov

● ASA – plocha prístupná pre rozpúšťadlo ●  Rg - gyračný polomer Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Charakteristika rozbalenej konformácie FAD ● ASA – plocha prístupná pre rozpúšťadlo ●  Rg - gyračný polomer ●  schopnosť tvorby vodíkových väzieb o ●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a gyračného polomeru Rg (R=0.844)

Zhrnutie: úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Zhrnutie: úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série 537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest 75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii

●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ...čo do budúcna? ●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus ●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach ●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu

Vám za vašu pozornosť! Poďakovanie RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Poďakovanie RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD. RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD. Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi Vám za vašu pozornosť!