mentor: prof. dr. sc. Ivica Grković Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora doktorant: Vana Košta mentor: prof. dr. sc. Ivica Grković Zavodu za anatomiju, histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta u Splitu

uvod Inervacija srca

Nodozni ganglij Imunohistokemijska obilježja neurotransmiteri: glutamat, katekolamini, serotonin, acetilkolin neuropeptidi: CGRP, ENK, galanin, NPY, SOM, SP, NKA, VIP IB4, N52, TRPV1 bjelančevine koje vežu kalcij: CALR, CALB, PARV

Imunohistokemijska obilježja “srčanih” neurona u nodoznom gangliju svega 2-5 % svih neurona nodoznog ganglija Aδ vlakna C vlakna 70% N52 61% IB4 20 % SP 17% CGRP 9%

Utjecaj tjelovježbe na srce povećanje udarnog srčanog volumena povećanje volumena desne i lijeve klijetke hipertrofija miokarda promjene u nadzornom djelovanju autonomnog živčanog sustava

Utjecaj tjelovježbe na vagus pojačana vagalna aktivnost smanjenje srčane frekvencije u mirovanju (Lin et al. 1972., Wisloff et al. 2001., Danson et al. 2003.) kardioprotektivni utjecaj tjelovježbe posredovan vagusom (Buch et al. 2002. i Buchheit et al. 2004.)

Utjecaj tjelovježbe na neurone povećanje broja neurona u hipokampusu koji eksprimiraju bjelančevine koje vežu kalcij (Arida i sur. 2004 i Choi i sur. 2009.) nastanak novih neurona u području hipokampusa (Jin i sur. 2008.) produljeno preživljenje neurona (van Praag i sur. 1999. i Jin i sur. 2008.)

Ciljevi istraživanja Obilježiti „srčane“ neurone unutar nodoznog ganglija koji se projiciraju u različite dijelove srca i obilježene skupine neurona usporediti brojčano, morfološki i imunohistokemijski. Utvrditi može li intenzivna aerobna tjelovježba i posljedična promjena srčane strukture izazvati promjene neurokemijskog fenotipa osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju štakora.

Hipoteze istraživanja Imunohistokemijske karakteristike osjetnih neurona koji inerviraju srčane klijetke i pretklijetke su različite. Tjelovježba i posljedične strukturalne promjene lijeve klijetke bit će dovoljan poticaj za kvantitativne i imunohistokemijske promjene osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju.

metode istraživanja Pokusne životinje DA LV DV LA N=4 kontrola N=6 Sprague-Dawley rats N=24 LA N=4 kontrola N=6 tjelovježba DA LV DV

Kirurški zahvat i obilježavanje neuronalnom bojom (Huikeshoven et al

Priprema tkiva Mjerna jedinica = 1mm na D, 400μm na E i 100μm na slici F

Dvostruka imunohistokemija Primarna i sekundarna protutijela protutijelo kat. br. vrsta razrijeđenje proizvođač primarno neurofilament 200 MAB 5266 miš 1:1000 Sigma, St. Louis, SAD kalretinin Ab702 zec 1:400 Abcam plc.332 , sekundarno zečji IgG-R F2507 magarac 1:200 Biotechnology mišji IgG (H+L), TR 71C3-1 koza Molecular Probes, Eugene, Oregon, SAD izolektin konjugiranim s fluorescein isotiocijanatom (FITC) (1:200, Sigma, St. Louis, SAD)

Tjelovježba 8 tjedana 60 min/dan 5 dana/tjedan nagib 10º 28 m/min

Statistički postupci Broj FB pozitivnih neurona, promjer stanica, tjelesna težina životinja i težina njihovih srdaca izražen je kao aritmetička sredina±SD. Hi-kvadrat test koristili smo za usporedbu imunopozitivnosti među skupinama, a za ostale podatke Kolmogorov-Smirnov test nakon kojeg je slijedio t-test ili ANOVA Obrada se napravila uz pomoć GraphPad (La Jolla, CA, USA) računarskog programa; razina statističke značajnosti je p<0,05.

rezultati Obilježja neurona nodoznog ganglija koji inerviraju srce štakora prosječan broj FB obojanih neurona u nodoznom gangliju 51 (51±30, 9-133) značajno veći br neurona koji se projicirao u klijetke nego u pretklijetke 65,8±35 vs. 39,6±21, p=0,03 N=1344

Neurokemijski fenotip i morfološka obilježja srčanih aferentnih neurona u nodoznom gangliju Izolektin pozitivni srčani neuroni 23% IB4+ neurona projicira se u desnu stranu srca dok se u lijevu stranu srca projicira 16% IB4+ neurona (p=0,01, Hi-kvadrat test). Mjerna jedinica = 50µm.

Neurofilament 200 pozitivni srčani neuroni 60% neurona je koji se projiciraju u lijevu klijetku su N52+, dok je udio N52+ neurona koji se projiciraju u desnu klijetku 44% (p=0,03, Hi-kvadrat test). Mjerna jedinica = 50µm.

Kalretinin pozitivni srčani neuroni 36% neurona koji se projiciraju u klijetke su CALR+, dok je samo 11% neurona koji se projiciraju u pretklijetke CALR+ (p<0,0001, Hi-kvadrat test). Mjerna jedinica = 25µm.

Neurokemijski profil neurona u nodoznom gangliju koji se projiciraju u različite dijelove srca. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama. FB obilježeni neuroni (N=736) lijeva pretklijetka (N=155) desna pretklijetka (N=179) lijeva klijetka (N=245) desna klijetka (N=157) IB4+ 19/155 (12) 37/179 (21) 45/245 (18) 41/157 (26) N52+ 43/76 (56) 46/82 (56) 70/116 (60) 31/70 (44) CALR+ 10/79 (13) 10/97 (10) 51/129 (40) 27/87 (31)

Neurokemijski profil dvostrukog bojenja (kolokalizacije) FB-om obilježenih neurona u nodoznom gangliju koji se projiciraju u različite dijelove srca. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama. FB obilježeni neuroni (N=736) lijeva pretklijetka (N=155) desna pretklijetka (N=179) lijeva klijetka (N=245) desna klijetka (N=157) IB4+N52+ 2/76 (3) 5/82 (6) 2/116 (2) 2/70 (3) IB4-N52- 26/76 (34) 22/82 (27) 26/116 (22) 20/70 (29) IB4+CALR+ 2/79 (3) 1/97 (1) 9/129 (7) 3/87 (3) IB4-CALR- 66/79 (84) 70/97 (72) 65/129 (50) 43/87 (49)

Utjecaj tjelovježbe na srce i neurone nodoznog ganglija štakora Utjecaj tjelovježbe na srce i tjelesnu težinu vježbanih i kontrolnih životinja. Vrijednosti su izražene kao aritmetičke sredine±S.D. kontrolne životinje vježbane životinje tjelesna težina, g 228±17,5 256±21,3 težina srca, g 0,956±0,06 1,093±0,16 težina srca/tjelesna težina, x1000 4,20±0,38 4,25±0,34

Neurokemijski profil neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u lijevu klijetku u životinja podvrgnutih tjelovježbi i u kontrolnih životinja. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama. FB+ neuroni kontrolnih životinja (N=238) FB+ neuroni životinja podvrgnutih tjelovježbi (N=176) IB4+ 83/238 (34) 57/176 (32) N52+ 73/118 (62) 55/77 (71) CALR+ 18/120 (15) 18/99 (18)

Mali broj neurona pokazao je dvostruka bojenja Mjerna jedinica = 50µm.

Utjecaj tjelovježbe na veličinu srčanih neurona U skupini podvrgnutoj tjelovježbi promjer N52+ neurona (24,5±4,5μm, N=30) značajno je veći i od promjera CALR+ (21,2±3,2μm, N=30) i od IB4+ neurona (21,4±4,2μm) (p=0,0071, jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) za nezavisne uzorke popraćena Bonferronijevim testom). Promjer N52+ neurona značajno je veći u životinja podvrgnutih tjelovježbi nego u životinja u kontrolnoj skupini (p=0,016, t-test za nezavisne uzorke).

Utjecaj tjelovježbe na promjene neurokemijskog fenotipa srčanih neurona tijekom vremena

Utjecaj tjelovježbe na imunohistokemijske karakteristike svih neurona unutar nodoznog ganglija Neurokemijski profil svih neurona nodoznog ganglija u životinja podvrgnutih tjelovježbi i kontrolnih životinja. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama. neuroni nodoznog ganglija kontrolnih životinja (N=1767) neuroni nodoznog ganglija životinja podvrgnutih tjelovježbi (N=1513) IB4+* 1280/1767 (72) 1176/1513 (78) N52+ 254/785 (32) 202/713 (28) CALR+ 77/982 (8) 69/800 (9) * p=0.007, Hi-kvadrat test

zaključci Neuroni koji se projiciraju u različite dijelove srca imaju različite imunohistokemijske karakteristike temeljene na njihovoj imunoreaktivnosti na IB4, N52 i CALR. Neuroni nodoznog ganglija koji šalju svoje projekcije u srce imaju drugačije osobine i to ne samo kada ih se uspoređuje međusobno (ovisno u koji dio srca se projiciraju) nego i kada ih se uspoređuje s ostalim neuronima u nodoznom gangliju ili s neuronima u spinalnim ganglijima koji se projiciraju u srce.

Rezultate pojedinih imunohistokemijskih bojenja neurona u štakora važno je promatrati u odnosu na dob životinja. Intenzivna tjelovježba u štakora ne dovodi do promjena u imunoreaktivnosti na IB4, N52 i CALR unutar neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u lijevu klijetku. Morfološka obilježja neurona koji se projiciraju u lijevu klijetku kao i imunohistokemijska obilježja ostalih neurona unutar nodoznog ganglija mijenjaju se kao odgovor na tjelovježbu.

Utvrđivanje postojanja različitih podskupina neurona koji su odgovorni za inervaciju točno određenog dijela srca važno je jer takve podskupine predstavljaju vrlo preciznu metu za daljnja istraživanja i potencijalni cilj na koji se može djelovati terapijski. Tjelovježbom uvjetovane morfološke i imunohistokemijske promjene neurona unutar nodoznog ganglija upućuju na mogućnost da je upravo nodozni ganglij inicijator vagalnih promjena koje nastaju kao posljedica dugotrajne tjelovježbe.