Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Inovativna škola za zelenu budućnost Kromatografija Edita Čupurdija, dipl.ing.kemije; univ.spec. oecoing.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Definicija: Kromatografija je metoda separacije (odjeljivanja) višekomponentnih sistema ( složenih smjesa). Učinkovita i svestrana metoda analize Primjena: kvalitativno razdvajanje smjese kvantitativno određivanje koncentracije komponenata u smjesi

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Povijesni osvrt Otkriće Mikail Semynovich Tswett-a početkom 20 stoljeća Primijenio je kromatografsku tehniku za odjeljivanje biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolazom kroz staklenu kolonu napunjenu sitnozrnatim kalcijevim (II)- karbonatom. Odijeljeni sastojci vide se na koloni kao obojene vrpce po kojima je tehnika dobila naziv (grčki chroma znači boja, a graphein pisati).

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Podjela kromatografskih sustava Kromatografski sustav čine tri faze pokretna (mobilna) faza nepokretna (stacionarna) faza ispitivani uzorak Pokretna i nepokretna faza su u dinamičkoj ravnoteži

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Postoje dvije vrste kromatografskih metoda:

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Plošna kromatografija i odjeljivanje na papiru

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji U kromatografiji na stupcu stacionarna faza ispunjava usku cijev kroz koju se mobilna faza kreće pod utjecajem tlaka ili gravitacije.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Plinska kromatografija (GC) Tekućinska kromatografija visokog učinka (HPLC/UPLC) Stacionarna faza : kruta tvar Mobilna faza : inertni plin Odvija se pri visokim temperaturama ( do 300˚C) Tehnika za određivanje termostabilnih spojeva, pesticida, masnih kiselina, alkohola i sl. Stacionarna faza : kruta tvar Mobilna faza: tekućina određenog sastava i pH Odvija se pri sobnoj temperaturi ili do 40˚C Tehnika za određivanje spojeva osjetljivih na visoke temperature ( neki lakohlapivi spojevi, vitamini i sl.)

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Prolaz molekula kroz porozni medij

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Kromatografski sustavi Plinsko-kromatografski sustav sastoji se od pet važnih dijelova: 1. Plin nositelj (inertni) 2. Injektor 3. Termostatirani dio (OVEN) 4. Kolona 5. Detektor ( ECD, NPD, FID, TCD, MS)

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Razdvajanje smjese na kapilarnoj koloni

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Primjena plinske kromatografije: Analize različitih vrsta štetnih spojeva u hrani, vodi i tlu ( pesticidi, hlapljivi klorirani i bromirani ugljikovodici, mineralna ulja …) Analize za provjeru kakvoće različitih proizvoda ( npr. masnih kiselina u uljima, volumni udio alkohola u alkoholnim pićima i slično) Analize za znanstvena istraživanja - Analize za medicinska istraživanja

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Kromatografski sustavi HPLC/UPLC kromatografski sustav sastoji se od: 1. Tekuće mobilne faze 2. Degazer 3. Injektora (autosampler) 4. Visokotlačne pumpe 5. Kolone 6. Detektora (UV/VIS, DAD, FLD, MS)

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Primjena tekućinske kromatografije: Analiza pesticida u vodi Analiza parametara kakvoće i zdravstvene ispravnosti prehrambenih proizvoda ( npr. sadržaj vitamina u vitaminskim napitcima, sadržaja konzervansa, hidrokumetilfurfural (HMF) u medu, šećera, umjetnih sladila, umjetnih boja, kapsaicina u ljutoj paprici, kofeina u kola napitcima, teina u čaju i sl) Analize različitih parametara u medicinskoj dijagnostici ( hormoni, antibiotici, vitamini i dr.) Analize za dokazivanje dopinga kod sportaša i slično Analize za znanstvena istraživanja

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Za valjane rezultate kromatografske analize potrebno je: Optimizirati metodu ( naći najbolje odnose između pripreme uzorka, tlakova, protoka mobilne faze i temperatura unutar sustava) da bi se dobilo odgovarajuće razdvajanje smjese pomoću poznatog standarda ( poznati sastav i poznata koncentracija).

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Kvalitativna analiza (GC, HPLC) Pridruživanje određenog maksimuma ( pika) pojedinoj komponenti smjese na određenom vremenu zadržavanja ( retencijsko vrijeme):

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Kvantitativna analiza (GC i HPLC/UPLC) Pridruživanje površine ispod pika poznatoj koncentraciji poznate komponente. Pri tome se uzima u obzir područje koncentracija ( 5 točaka) koje linearno ovise o odzivu detektora, pa se ta linearna ovisnost može prikazati jednadžbom pravca: nagib pravca Y= a X+ b odziv detektora odsječak na osi Y poznata koncentracija

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Površina ispod pika Površina jednakostraničnog trokuta čiji je vrh na retencijskom vremenu.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Kalibracija (GC,HPLC) obuhvaća kvalitativnu i kvantitativnu analizu smjese poznatog sastava i poznatih koncentracija u 5 odabranih točaka. Validacija analitičke metode (GC,HPLC): neophodna za dokazivanje valjanosti metode obuhvaća niz mjerenja za dokazivanje potrebnih parametara valjanosti metode (ponovljivost mjerenja,ponovljivost pripreme uzorka, iskorištenje, kalibracija i drugi).

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Mjerna nesigurnost (MN) (GC,HPLC) - niz statističkih obrada mjernih podataka dobivenih unutar validacije metode koji sva ukupna mjerenja svode na jedan broj. - Prikazuje odstupanje od prave vrijednosti. - Npr: izmjerena vrijednost ± MN

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Valjanost metode potvrđuje se međulaboratorijskom usporedom i Akreditacijom prema normi HRN EN ISO/IEC 17025:2007 „ Opći zahtjevi za osposobljenost ispitnih i umjernih laboratorija”

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Metoda ispitivanja može biti napravljena prema standardu tj. normi za ispitnu metodu Laboratorij za kromatografiju ima više akreditiranih normiranih metoda: 1. HRN EN ISO 6468:2002 ( određivanje organoklornih pesticida i PCB u vodi) 2. HRN EN ISO 10695:2002 ( određivanje triazinskih pesticida u vodi) 3. HRN EN ISO 12918:2002 (određivanje organofosfornih pesticida u vodi)

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji 4. HRN EN ISO 12966-1:2015 (određivanje sadržaja masnih kiselina u biljnim i životinjskim mastima)

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji ECD (Elektron Capture Detector) ili detektor elektronskog zahvata Primjena: Analiza organskih spojeva s elektronegativnim funkcionalnim skupinama ( halogeni elemanti: F,Cl,Br, J; posfati, nitro grupe …) - Sadrži β-emiter ( 63-Ni jezgru) koji ionizira plin nositelj (N2) i stvara konstantnu struju između dviju elektroda

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji Prolaskom organskih molekula s elektronegativnim funkcionalnim skupinama dolazi do zahvata elektrona što uzrokuje smanjenje struje između elektoda što se bilježi kao promjena u izlaznom signalu detektora. - Nakon detektora nalazi se pojačalo signala što rezultira pojavom pika na kromatogramu.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji FID (Flame Ionizaton Detector) ili plameno ionizacijski detektor Primjena: analiza različitih organskih molekula: alkoholi, masne kiseline, ravnolančani, aromatski ugljikovodici. Princip rada: Detekcija iona koji nastaju u procesu sagorijevanja u vodikovom plamenu - Nastajanje iona je proporcionalno koncentraciji organske tvari u struji plina nositelja (N2)

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji Primarna reakcija u plamenu: CH + O → CHO+ + e- Sekundarna reakcija u plamenu CHO+ + H2O → H3O+ + CO

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji MSD (Mass Spectometry Detector) Ili detektor masene spektrometrije Primjena: - univerzalni detektor za GC i HPLC/UPLC Radi na principu fragmantiranja molekula pri čemu nastaje jedinstveni spektar masa za pojedinu molekulu Svaki spektar masa molekule je specifičan da se može usporediti s otiskom prsta čovjeka. - Dvije molekule iste empirijske formule nemaju iste fragmente

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji Shematski prikaz MSD

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji DAD (Dode Array Detector) ili Detektor s velikim brojem fotodioda Najčešći detektor za HPLC/UPLC Ugradnjom većeg broja fotodioda omogućeno je paralelno praćenje većeg broja spojeva s različitim valnim duljinama apsorpcije - Područje valnih duljina 190 – 800 nm

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Detektori u kromatografiji

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Organoklorni pesticidi (OCP) su skupina sintetiziranih organskih spojeva koji se primjenjuju u poljoprivredi za suzbijanje insekata, korova i različitih drugih štetočina koji umanjuju poljoprivredne prinose.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Takvi spojevi se nakon primjene ispiru s kišom ili navodnjavanjem kroz tlo i dospijevaju u podzemne vode i u površinske vode, te tako mogu ozbiljno utjecati na razvoj biljnih i životinjskih vrsta vodenog svijeta pa i na druge vrste koji istu vodu koriste za život.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Većina od tih spojeva su kancerogeni ili su anatgonaisti spolnih hormona pa mogu izazvati sterilnost ili mogu biti antagonisti vitamina K i spriječiti sitezu vitamina K, te time i stvaranje protrombina i onemogućavati zgrušavanje krvi kao što su karbamati i sl.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Toksičnost ovih kemikalija je opravdanje za praćenje prisutnosti istih u najvažnijoj 'namirnici' za održanje života na Zemlji – VODI Zbog toga su ovakve analize neophodne i redovito se primjenjuju u praćenju monitoringa površinskih voda i u vodama za piće.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Skupinu organoklornih pesticida čine: a-HCH, b-HCH,y-HCH (lindan), d-HCH, aldrin, dieldrin,endrin, endosulfan I i II, endrin aldehid, endosulfan sulfat, heptaklor, heptaklor-epoksid, o,p-DDT, p,p-DDT, DDE, DDD, klordan, PCB-i i drugi MDK (maksimalna dozvoljena koncentracija) = 0,1 µg/L

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Priprema uzorka vode Ekstrakcija tekuće-tekuće s organskim otapalom petroleterom koje se bazira na Nernstovom zakonu razdjeljenja: KD = cA/cB tvar se raspodjeljuje između dva otapala tako da je omjer koncentracija te tvari pri nekoj temperaturi stalan, uz uvjet da se u oba otapala tvar nalazi u istom molekularnom obliku.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Zbog Nernstovog zakona razdjeljenja potrebno je raditi više ekstrakcija uzastopno kako bi se ekstrahirala maksimalna količina tvari koju želimo odrediti. - Za organoklorne pesticide uobičajeno je raditi 3 uzastopne ekstrakcije s istim volumenima petroletera, a vrijeme između dvije ekstrakcije je 1 sat.

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi U periodu od jednog sata dolazi do uspostave ravnoteže na granici između organske i vodene faze pri čemu se organoklrorni pesticidi na dodiru dviju faza raspodjeluju u organsku fazu u kojoj je topivija. Kroz 3 ekstrakcije postiže se maksimalna ekstrakcija. Uparavanje ( ukoncentriravanje) ekstrakata na 1 ml

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi 2. Kvalitativna i kvantitativna analiza na plinskom kromatografu s ECD detektorom Kalibracija u linearnom koncentracijskom području 0,05 -0,15 µg/L

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi - Linerana ovisnost odziva detektora s porastom koncentracija prikazuje se jednadžbom pravca Koncentracija organoklornih pesticida (µg/L) Odziv detektora (Srednja vrijednost površine pika u Hz) 0.05 6195.62 0.06 8263.04 0.075 1.03317e4 0.08 1.14210e4 0.1 1.40424e4 0.125 1.85465e4 0.150 2.21341e4

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Jednadžba pravca: y= 150301.94x –657.35   - Koeficijent korelacije : R2 = 0.9982 - Nagib pravca : 150301.94 - Odsječak na osi Y : - 657.35

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje organoklornih pesticida u vodi Primjer izračuna koncentracije lindana: x= (Y+657.35) / 150301.94 x= (1.28 x 104+657.35) / 150301.94 x= 0.089 µg/L ili 0.09 µg/L Y = odziv detektora x = izračunata koncentracija

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje HMF –a Medu HMF ili Hidroksimetil furaldehid

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje HMF –a Medu HMF ili Hidroksimetil furaldehid UVJETI METODE: λ = 280 nm (Ref=360nm) T (kolone) = 30⁰C protok = 1,0 ml/min p = 190-205 bara ( pmax = 330 bara) V (iniciranja uzorka) = 20 µL

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje HMF –a Medu HMF ili Hidroksimetil furaldehid Kromatogram standarda HMF

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje HMF –a Medu HMF ili Hidroksimetil furaldehid Kalibracijski pravac dobiven iz koncentracijskog područja od 5 točaka

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji Određivanje HMF –a Medu HMF ili Hidroksimetil furaldehid Kromatogram svježeg livadskog meda

Instrumentalne metode u analitičkoj kemiji HVALA NA PAŽNJI