reakcie antigénu s protilátkou Imunochemické metódy reakcie antigénu s protilátkou sérologické metódy, precipitačné metódy, enzýmové imunometódy, imunoanalýzy s použitím častíc a v suchej fáze, imunoelektrometódy, imunoafinitné metódy,...

Imunochemické metódy založené na reakcii antigén – protilátka sily uplatňujúce sa pri väzbe vodíkové väzby hydrofóbne interakcie Coulombove sily (elektrostatické interakcie) van der Waalsove sily (Londonove disperzné sily) väzba je reverzibilná a na silu interakcie má vplyv prostredie a afinita rovnovážna asociačná konštanta

Detekcia imunokomplexu voľným okom precipitát (rozpustné antigény) aglutinát (nerozpustné antigény, bunky,...) po zafarbení precipitátu optické metódy turbidimetria nefelometria označenie jedného z reaktantov značkou rádioizotopy 125I, 3H, 14C, 75Se (RIA) enzýmy (EIA, ELISA) fluorochrómy (FIA) chemiluminofóry (CIA) stabilné voľné radikály (SIA, FRAT) častice (PHI, PACIA) zlúčeniny kovov (MIA) bakteriofágy (VIA)

Sérologické metódy kvapalné prostredie (metódy 1. generácie) imunoprecipitácia Ag = precipitogén, Ab = precipitín imunoaglutinácia Ag = aglutinogén, Ab = aglutinín priama a nepriama (kvantifikácia podľa kompetície) hemaglutinačné metódy na erytrocytoch metódy využívajúce väzbu komplementu veľmi citlivé, ale ťažko kvantifikovateľné skríningová diagnostika

Precipitačné metódy sérologické kvantitatívna precipitácia nefelometria – fluorescenčná, laserová turbidimetria gélové imunodifúzne Ouchterlony rádiálna imunodifúzia (RID) imunoelektroforetické Grabar a Williams imunoelektrodifúzia (raketová) imunoelektrosyneréza (stretná) dvojrozmerná (krížová) imunofixácia po elektroforéze

Blottovacie metódy Southern 1975 southern blot DNA na nitrocelulózu Alvine 1977 northern blot RNA na diazobenzoyloxymetylovaný papier Burnette 1981 western blot proteíny na nitrocelulózu al. PVDF dot immunobinding assay (DIBA) detekcia < 1 μg/ml Ig Petri dish-Agar Dot Immunoenzymatic Assay (PADIA) ako DIBA, ale na PM a substrát je v agare multianalyte immunoassay mikrospot 10-50 μm2 t.j. 106 proteínov na chipe identifikácia tenkým Xe laserom

Enzýmové imunoanalýzy EIA, EMIT homogénna (inhibícia enzýmovej aktivity – netreba oddeľovať IK) heterogénna ELISA kompetitívna/nekompetitívna priama/nepriama detekcia ELISPOT imobilizácia protilátky na membránu saturácia rast buniek + produkcia Ab, cytokínov,... odmytie buniek sendvičová ELISA

Enzýmové imunoanalýzy CEDIA cloned enzyme donor immunoassay enzým (β-galaktozidáza) je rozdelený na 2 neaktívne fragmenty enzýmový donor (5 % veľkosti enzýmu) enzýmový akceptor (95 % veľkosti enzýmu) jeden z nich je naviazaný na antigén po väzbe na protilátku sa nemôže skompletizovať aktívny enzým (tetramér) v prítomnosti antigénu sa voľný antigén s fragmentom enzýmu spojí do funkčného enzýmu s druhou časťou a má enzýmovú aktivitu

Enzýmové imunoanalýzy enzýmová imunochromatografia strip s imobilizovanými protilátkami (Whatman 31ET) vzorka a haptén s naviazaným enzýmom sa nechajú vzlínať (GOD, haptén-peroxidáza) detekcia enzýmovej aktivity (glukóza, 4-chloro-1-naftol) výška farebnej zóny je priamo úmerná množstvu antigénu/hapténu vo vzorke žiadne vybavenie kvantitatívne rýchle (10 min) nezávislé na aktivite kompetícia

Rádioaktívne imunometódy RIA rádioimunoanalýza (značený Ag, H) IRMA imunorádiometrická analýza (značená Ab) Rosalyn Yalow 1977 Nobelova cena citlivosť v pg/ml (napr. prostaglandín F2α) rádioizotopy: 125I naviazaný na tyrozín použitie: detekcia užívania drog

Fluorescenčné a chemiluminiscenčné metódy FIA fluorescence immunoassay ako EIA FPIA fluorescence polarization imunoassay Ag-fluoresceín (polarizované λex=490nm λem=520nm) IK rotuje pomalšie ako samotný Ag a tak emituje viac kompetícia bez separácia – robotizácia fluorescence excitation transfer immunoassay Ag + (Ag-F)-(Ab-R) ↔ Ag-(Ab-R) + Ag-F Ag + Ab-F + Ab-R → (Ab-R)n-Ag-(Ab-F)m PCFIA particle concentration FIA protilátky naviazané na častice a sendvič zhášanie fluorescencie fluorescence quenching fluorescencia Ab je zhášaná po naviazaní Ag CIA chemiluminiscence immunoassay vysoká citlivosť 10-18 – 10-21 mol

Problémy s fluorescenciou autofluorescencia sérové proteíny bilirubín zvýšené pozadie resp. základná línia zhášanie fluorescencie hemoglobín photobleaching pri dlhšom ožiarení fluorfóru slabne intenzita emitovaného žiarenia

Imunoanalýzy s použitím častíc hemaglutinačné metódy – pasívna inhibícia hemolýzy SPIA sol particle immunoassay častice zlata 50 μm (Au50-Ab) sú červené a po naviazaní antigénu sa odfarbia (Au50-Ab-Ag(H)) hCG – vizuálne 170 pmol/L, kolorimetricky 5 pmol/L, atómová absorbčná spektrometria 0,02 pmol/L PACIA particle counting immunoassay počítanie neaglutinovaných častíc výhody nie je potrebná separácia rýchle relatívne citlivé

Imunoanalýzy v suchej fáze Požiadavky všetky reagencie umiestniť do jedného zariadenia (prúžok papiera), ktorý sa aktivuje pridaním vzorky jednoduchý merací prístroj (ak je vôbec potrebný) Príklady Homogénne imunoanalýzy bez separačných medzistupňov SLFIA substrate-labelled fluorescent immunoassay substrát s neaktívnym fluorochorom sa po naviazaní na Ab neštiepi, ale voľný sa štiepi enzýmom na aktívnu formu ARIS apoenzyme reactivation immunoassay system Ab proti liečivu, aGOD, peroxidáza, glukóza konjugát liečivo-FAD, substrát

Imunoafinitné elektródy antigénové (potiahnuté Ag) protilátkové (potiahnuté Ab) Imunosenzory piezoelektrické kryštálové (založené na zmene rezonančnej frekvencie piezoelektrických kryštálov po naviazaní protilátky) založené na fluorescenčnej excitácii (svetlom cez svetlovod excitujeme fluorescenčný materiál naviazaný na protilátkach a tým istým svetlovodom zachýtávame signál) s detekciou na báze surface plasmon resonance s detekciou FRET ... a iné kontinuálne meranie viacnásobné použitie

DNA/RNA sondy detekcia špecifických úsekov DNA/RNA produkty PCR reakcií Ab proti analógom nukleotidov, hapténom naviazaným na DNA sondu

Zvýšenie citlivosti sekundárne protilátky enzýmy biotín-streptavidín použitie častíc (aglutinácia) alternatívne metódy detekcie (AAS, fluorescencia, chemiluminiscencia...) receptor ligand afinita lektín glykoproteín 10-3 – 10-5 enzým substrát 10-3 – 10-6 protilátka antigén 10-7 – 10-11 hormón 10-9 – 10-11 avidín biotín 10-15