DNA – Μηχανισμοί επιδιόρθωσης Μιχάλης Β. Καραμούζης MD, PhD Παθολόγος Ογκολόγος Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Devlin – Κεφάλαιο 4 Lehninger – Κεφάλαιο 25 Παραδόσεις Αμφιθεάτρου Μάρτιος 2018

Βλάβες στο DNA DNA πρέπει να παραμένει σταθερό από γενιά σε γενιά Ημισυντηρητική αντιγραφή / μηχανισμός αλάθητος? Λάθη αντιγραφής Περιβάλλον / μεταλλαξιογόνα / ΒΛΑΒΕΣ Μη επιδιόρθωση βλαβών οδηγεί σε ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ

Βλάβες οφειλόμενες σε λάθη της αντιγραφής Αντιγραφή πιστή αλλά λόγω ταχύτητας λάθη Γλύστρημα πολυμεράσης αφήνει αζευγάρωτες βάσεις στον πατρικό κλώνο και έτσι εισάγονται λάθη (DNA replication slipage) Proofreading Pol δεν επιδιορθώνει και έτσι λάθος ζεύγος - Μπορεί να επιδιορθωθεί αργότερα

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες Προκλητές (χημικά – ακτινοβολίες - θερμοκρασία) και αυθόρμητες βλάβες όπως Απαμίνωση κυτοσίνης Αποπουρίνωση

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες

Βλάβες οφειλόμενες σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες

Μετάλλαξη - ορισμός Αλλαγή στο DNA ενός οργανισμού που είναι κληρονομήσιμη, είτε στο επίπεδο του κυττάρου (σωματικές μεταλλάξεις), είτε στο επίπεδο του οργανισμού (μεταλλάξεις στα γαμετικά κύτταρα) Προκύπτουν από σφάλματα αντιγραφής, βλάβη του DNA ή από σφάλματα των μηχανισμών επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA Μεταλλάξεις απαρατήρητες, που συμβαίνουν εσώνια ,διαστηματικό ΔΝΑ Άλλες οδηγούν σε κατρκινογένεση / πρωτο-ονκογ ογκογ.

Μετάλλαξη - ορισμός Μεταπτώσεις ή Μεταστροφές V11

Μηχανισμοί Επιδιόρθωσης Άμεση και Έμμεση Επιδιόρθωση Άμεση Επιδιόρθωση κατά την αντιγραφή 3’ - 5’ Ο-6mG MT (MGMT) Διμερών Τ-Τ στα φυτά (φωτολυάση) Έμμεση Εκτομή βάσης ΒΕR Εκτομή νουκλεοτιδίου NER MMR Ομόλογο ανασυνδυασμός

επίδραση αλκυλιούντων παραγόντων Άμεση Επιδιόρθωση (MGMT) Τροποποιημένο νουκλεοτίδιο από την επίδραση αλκυλιούντων παραγόντων

Μηχανισμός άμεσης επιδιόρθωσης - MGMT Ενζυμο αυτοκτονίας. Η μεθυλοτρανσφεράση της Ο6-mG (MGMT)

Μηχανισμός άμεσης επιδιόρθωσης - MGMT Ενζυμο αυτοκτονίας. H μεθυλίωση της MGMT καθιστά την πρωτεϊνη ανενεργή και αποδομείται με ουβικιτίνωση

Άμεση επιδιόρθωση - Φωτοενεργοποίηση Χωρίς αφαίρεση βάσης ή νουκλεοτιδίου Διμερή πυριμιδίνης από υπεριώδη ακτινοβολία Άμεση φωτο-επανενεργοποίηση των διμερών κυκλοβουτανο-πυριμιδίνης – DNA φωτολυάσες Χρησιμοποιούν ενέργεια από το απορροφούμενο φως Περιέχουν 2 συν-παράγοντες

Άμεση επιδιόρθωση - Φωτοενεργοποίηση ΔΕΝ ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ V12

Άμεση επιδιόρθωση – Proof reading Σύμπλεγμα αντιγραφής Αποσυναρμολόγηση ή οπισθοχώρηση Παράκαμψη της βλάβης Υπερπήδηση της βλάβης – Κενό στο θυγατρικό κλώνο

Άμεση επιδιόρθωση – Proof reading Αποσυναρμολόγηση ή οπισθοχώρηση Παράκαμψη της βλάβης Υπερπήδηση της βλάβης – Κενό στο θυγατρικό κλώνο

Άμεση επιδιόρθωση – Proof reading

Άμεση επιδιόρθωση – Proof reading Η DNA πολυμεράση η μπορεί να ενσωματώνει Α απέναντι από τα διμερή ΤΤ - Δε διαθέτει ικανότητα επιδιόρθωσης Η DNA πολυμεράση ι ενσωματώνει νουκλεοτίδια απέναντι σε άλλες βλάβες που δεν μπορούν να αποτελέσουν εκμαγείο Η DNA πολυμεράση ζ μπορεί να επεκτείνει τις δομές που δημιουργούνται από τις παρακαμπτήριες DNA πολυμεράσες Είναι διανεμητικά ένζυμα – μικρή πιθανότητα εισαγωγής μεταλλαγών V13

Άμεση επιδιόρθωση – Proof reading Αποσυναρμολόγηση ή οπισθοχώρηση Παράκαμψη της βλάβης Υπερπήδηση της βλάβης – Κενό στο θυγατρικό κλώνο

Άμεση επιδιόρθωση – Proof reading Σύμπλεγμα αντιγραφής Αποσυναρμολόγηση ή οπισθοχώρηση Παράκαμψη της βλάβης Υπερπήδηση της βλάβης – Κενό στο θυγατρικό κλώνο

DNA – Μηχανισμοί επιδιόρθωσης Κλινικές Προεκτάσεις

Κλινικό Παράδειγμα Ι Νόσος Huntington Οφείλεται σε μεταλλαγή τύπου επέκταση τριπλέτας Κληρονομήσιμη νόσος Ο αριθμός των επιπλέον τριπλετών καθορίζει και την ηλικία εμφάνισης των συμπτωμάτων V14

Κλινικό Παράδειγμα ΙI MGMT και Γλοιώματα του Εγκεφάλου Μεθυλίωση της MGMT των καρκινικών κυττάρων οδηγεί σε αδυναμία επιδιόρθωσης βλαβών που προκαλούνται από αλκυλιούντες παράγοντες Τεμοζολαμίδη Οι ασθενείς με όγκους με μεθυλιωμένη MGMT που λαμβάνουν τεμοζολαμίδη έχουν πολύ μεγαλύτερη επιβίωση V15

DNA – Μηχανισμοί επιδιόρθωσης Μιχάλης Β. Καραμούζης MD, PhD Παθολόγος Ογκολόγος Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Devlin – Κεφάλαιο 4 Lehninger – Κεφάλαιο 25 Παραδόσεις Αμφιθεάτρου Μάρτιος 2018

Μηχανισμοί Έμμεσης Επιδιόρθωσης Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (BER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (NER) Επιδιόρθωση λανθασμένων ζευγών (ΜΜR)

Μηχανισμοί Έμμεσης Επιδιόρθωσης Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (BER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (NER) Επιδιόρθωση λανθασμένων ζευγών (ΜΜR)

Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (BER) DNA γλυκοζυλάσες - αναγνωρίζουν πολύ κοινές βλάβες του DNA και αφαιρούν τη προσβεβλημένη βάση διασπώντας τον Ν-γλυκοζιτικό δεσμό (ειδικότητα, πολυπλοκότητα σε ευκαρυώτες) Θέση ΑΡ (αβασική θέση) – απουρινική ή απυριμιδική θέση στο DNA ΑΡ ενδονουκλεάσες – κόβουν τον κλώνο DNA που περιέχει τη θέση ΑΡ ΑΡ λυάση – κόβει από το 3’ άκρο την ΑΡ θέση για αφαίρεση του σακχάρου DNA πολυμεράση Ι – αντικαθιστά το DNA DNA λιγκάση – αποφράσσει την εντομή

Αντιγραφή

Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (BER) Τουλάχιστον 8 διαφορετικές γλυκοζυλάσες στον άνθρωπο DNA γλυκοζυλάση της ουρακίλης

Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (BER) V16

Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων - (BER) PARPs (Poly (ADP-ribose) polymerases Αυξημένη δράση με την επίδραση παραγόντων που προκαλούν βλάβες του DNA Τουλάχιστον 18 μέλη Συνδέονται σε περιοχές με DNA SSBs

Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων PARPs (Poly (ADP-ribose) polymerases (BER) PARPs (Poly (ADP-ribose) polymerases

Μηχανισμοί Έμμεσης Επιδιόρθωσης Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (BER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (NER) Επιδιόρθωση λανθασμένων ζευγών (ΜΜR)

με εκτομή νουκλεοτιδίων (NER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίων (NER) Διμερή πυριμιδίνης από υπεριώδη ακτινοβολία Βενζοπυρένιο, αφλατοξίνη, σισπλατίνη

με εκτομή νουκλεοτιδίων (NER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίων (NER) V17

με εκτομή νουκλεοτιδίων (NER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίων (NER) V18

TCR-Transcription Coupled Repair

Μηχανισμοί Έμμεσης Επιδιόρθωσης Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (BER) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (NER) Επιδιόρθωση λανθασμένων ζευγών (ΜΜR)

Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR) Επιδιορθώνει λάθη αντιγραφής (DNA pol) Insertion - deletion λίγων βάσεων «Γλίστρημα» slipage πολυμερασών σε ασταθείς περιοχές του DNA Αναγνωρίζει νεό κλώνο Δρα με διαφορετική ικανότητα σε ζεύγη Συνεργάζεται με άλλα συστήματα Δυσλειτουργία του ΜΜR καρκινογένεση

αταίριαστων ζευγών (MMR) Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR)

Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR)

Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR)

αταίριαστων ζευγών (MMR) Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR) V19

αταίριαστων ζευγών (MMR) Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR) Ευκαρυωτικά κύτταρα παρόμοιες πρωτεϊνες (ΕΚΤΟΣ από MutH) MutS --- MSH2, MSH3, MSH6 MutL ---MLH1, PMS1 Μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεϊνες σχετίζονται με σύνδρομα κληρονομικής προδιάθεσης σε κακοήθη νεοπλάσματα

αταίριαστων ζευγών (MMR) Επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών (MMR) Oπως στα βακτήρια αλλά πιο πολύπλοκος. Την εκτομή του νέου κλώνου την κάνει η ενδονουκλεάση FEN. V20

DNA – Μηχανισμοί επιδιόρθωσης Κλινικές Προεκτάσεις

Κλινικό Παράδειγμα IIΙ Μελαγχρωματική ξηροδερμία (XP)

Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίων δε λειτουργεί σωστά Μελαγχρωματική ξηροδερμία Xeroderma Pigmentosum Ελλειμματική ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΔΙΜΕΡΩΝ ΘΥΜΙΝΗΣ Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίων δε λειτουργεί σωστά Ελαττωματική επιδιόρθωση ογκωδών συμπλόκων (διμερών θυμίνης, κ.ά). Μεταλλάξεις στα γονίδια επιδιόρθωσης (XPΑ –XPG) Σοβαρή φωτοευαισθησία 1000 φορές αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του δέρματος και άλλων καρκίνων V21 56

Κλινικό Παράδειγμα IV HNPCC – Lynch Syndrome

Microsatellite Instability (MSI) Μικροδορυφορικές αλληλουχίες επαναλαμβανόμενων βάσεων όπου η μονάδα επανάληψης αποτελείται από μία έως τέσσερις βάσεις βρίσκονται διάσπαρτες στο γονιδίωμα συνήθως δεν κωδικοποιούν μπορούν όμως να υπάρχουν και στις κωδικές περιοχές γονιδίων Ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά που παρατηρούνται σε καρκίνους ασθενών με HNPCC αλλά και σε όλους τους ασθενείς με Καρκίνο Παχέος Εντέρου είναι η μικροδορυφορική αστάθεια. Μικροδορυφορικές αλληλουχίες επαναλαμβανόμενων βάσεων όπου η μονάδα επανάληψης αποτελείται από μία έως τέσσερις βάσεις βρίσκονται διάσπαρτες στο γονιδίωμα συνήθως δεν κωδικοποιούν μπορούν όμως να υπάρχουν και στις κωδικές περιοχές γονιδίων

Microsatellite Instability (MSI) Αφορά περιοχές με επαναλήψεις δι, τρι τετρα-νουκλεοτιδίων Έχει βρεθεί ότι άτομα με ελαττωματικό μηχανισμό MMR συσσωρεύουν μεταλλάξεις Αυτή η συσσώρευση ονομάζεται αστάθεια μικροδορυφορικού DNA Όταν αυτό μελετηθεί ως προς τους πολυμορφισμούς του με τεχνικές Μ.Β., είναι μία ένδειξη για την ύπαρξη ελαττωματικού ΜΜR

Microsatellite Instability (MSI) Λάθη κατά την κυτταρική διαίρεση στην αντιγραφή τέτοιων αλληλουχιών συνήθως διορθώνονται από το σύστημα MMR. Έτσι μία ένδειξη για μεταλλαγή σε ένα από αυτά τα γονίδια είναι η ανάλυση μικροδορυφόρων για την ανίχνευση μικροδορυφορικής αστάθειας

Microsatellite Instability (MSI) PCR on tumor DNA for MSI Βλάβες στο μηχανισμό επιδιόρθωσης κακώς ζευγαρωμένων βάσεων είναι βιολογικό χαρακτηριστικό ~15% των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου σταδίου ΙΙ. Έλλειψη της έκφρασης των πρωτεϊνών MMR (MissMatch Repair) στον όγκο, ειδικά των MLH1 και MSH2 (αποτελούν >95% των ασθενών με αυτό το χαρακτηριστικό), έχει ως αποτέλεσμα την ανικανότητα της πιστής αντιγραφής του DNA που χαρακτηρίζεται από μικροδορυφορική αστάθεια (MSI). Εντερικοί όγκοι με αυτό το βιολογικό χαρακτηριστικό ταυτοποιούνται με εκτίμηση δεικτών στο DNA μέσω PCR. Όπου παρατηρείται υψηλή αστάθεια (MSI-H) υπάρχει έλλειψη πιστής αντιγραφής του DNA στον καρκινικό ιστό σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Σε καρκίνους με MSI-H (υψηλή μικροδορυφορική αστάθεια) το DNA του όγκου είναι διαφορετικού μήκους σε σχέση με αυτό του φυσιολογικού ιστού (κάτω δεξιά εικόνα). Ανεπάρκεια του μηχανισμού επιδιόρθωσης κακώς ζευγαρωμένων βάσεων (MMR Deficiency) έχει ως άμεση συνέπεια σε υψηλή μικροδορυφορική αστάθεια (MSI-H).

Microsatellite Instability (MSI) V22

Η MSI-H είναι ευνοϊκός προγνωστικός παράγοντας Sinicrope et al. JNCI 2011;103:863

Οι ασθενείς με MSS ωφελούνται από τη βασισμένη στη 5-FU ΧΜΘ Οι ασθενείς με MSI-H ΔΕΝ ωφελούνται από τη βασισμένη στη 5-FU ΧΜΘ Sinicrope et al. JNCI 2011;103:863

MSI & Mutation burden The Cancer Genome Atlas Network. Nature 2012;487:330