Dr. Mihai Lazar INBI Prof. Dr. Matei Bals UMF Carol Davila FIBRINOLIZA Dr. Mihai Lazar INBI Prof. Dr. Matei Bals UMF Carol Davila

FIBRINOLIZA Plasminogenul – β2 globulina termolabila sintetizata hepatocitar T ½ - 2 ore Forme - liber 20% - se fixeaza pe cheagul de fibrina - legat - 50% de histidina - 30% de α2 antiplasmina

FIBRINOLIZA Transformarea plasminogenului in plasmina, cu degradarea fibrinei si fibrinogenului (Va, VIIIa) plasmina Fibrina PDF (produsi de degradare ai fibrinei): X, Y, D, E D X D Y E

FIBRINOLIZA Degradarea fibrinogenului nu determina D dimeri Hiperfibrinoliza – productie crescuta de plasmina - Congenital – deficit de α2 antiplasmina, tPA in cantitati crescute/PAI in cantitati reduse Dobandita – CH (reducerea clearance-ului activatorilor plasminogenului) Iatrogena – SK, UK

FIBRINOLIZA Factori activatori: tPA (activator tisular al plasminogenului) sPA (activator sangvin al plasminogenului) FXIIa UK, SK fibrina, trombina Factori inhibitori: PAI (inhibitor al activatorului plasminogenului) α2 antiplasmina α2 macroglobulina

FIBRINOLIZA Hiperfibrinoliza - primara - interventii chirurgicale pe organe bogate in tPA (uter, prostata, plaman) - secundara – CID, neoplasme, deficite ereditare PAI, α2 antiplasmina (proteoliza fibrinei, fibrinogenului, F V, F VIII) Evaluare – formele subacute si cronice - formele acute/ supraacute – dificil de evaluat

FIBRINOLIZA – Teste globale TLCS (timpul de liza al cheagului sangvin) N 48-72 ore Hiperfibrinoliza - subacuta <48h - acuta < 1h - supraacuta – nu se produce cheagul de sange Hipofibrinoliza > 72 ore

FIBRINOLIZA – Teste globale TLCE (timpul de liza al cheagului euglobulinic) Metoda rapida Se poate efectua si pe sange heparinizat Metoda: plasma este diluata, apoi acidifiata cu a. acetic, determinand aparitia unui precipitat ce contine: plasminogen, fibrinogen, tPA, uPA, factori ai coagularii; inhibitorii activatorilor plasminogenului raman in supernatant. Precipitatul se dizolva, se adauga CaCl2 si se cronometreaza aparitia cheagului si liza acestuia N 3h Valori reduse - hiperfibrinoliza (tPA crescut) - desprindere de placenta, retentie de fat mort - CH, IH - deficit de α1 antitripsina - traumatisme, electrocutari - neoplazii

FIBRINOLIZA – Teste globale Trombelastografia Inregistreaza modificarile fizice ale sangelui/plasmei in momentul coagularii in trombelastograf - supraveghere vizuala si inregistrare pe hartie fotosensibila - evalueaza dinamica elasticitatii dupa formare, maturarea cheagului, retractia cheagului si liza cheagului - evalueaza atat elementele celulare cat si cele umorale (temperatura, pH, Ca)

FIBRINOLIZA – Teste analitice Determinarea plasminogenului, tPA, α2 antiplasmina, PAI prin masurare directa utilizant metode imunologice sau biologice Determinarea PDF Determinarea DD

Plasminogenul Deficiența ereditară este rară predispunând la tromboză Valori normale: 75 – 130 %; 6 – 14 g/dl.

Plasminogenul Metode: Metoda funcțională: Metoda imunologică: Se adauga streptokinaza + substrat cromogenic; Metoda imunologică: Radial imunodiffusion assay Determina cantitatea de plasminogen.

Plasminogenul Deficiența dobândită: Deficiența ereditară: Terapie trombolitica Disfuncție hepatică Consum (CID) Deficiența ereditară: Rară Deficitul sever e asociat cu conjunctivitis lignosa: conjunctivită pseudomembranoasă caracterizată prin depozite masive de fibrină depozitele de fibrină se datorează absenței sau scăderii clearence-ului fibrinei de către plasminogen

Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1) PAI-1 inhibă activatorul tisular al plasminogenului, t-PA Nivele crescute de PAI-1 sunt asociate cu tromboza arteriala datorată inhibării fibrinolizei Deficitul de PAI-1 se asociază cu sindromul hemoragipar datorită fibrinolizei excesive Valori normale: 4 – 40 ng/ml (metada imunologică) 0 – 12 unitati/ml (metoda funcțională) PAI-1 prezintă ritm circadian.

Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1) Metoda funcțională: Plasma este adaugată unei cantități cunoscute de urokinaza PAI-1 din plasma pacientului leaga urokinaza restul de urokinază este inactivat prin adaugare de plasminogen, care va fi transformat in plasmină plasmina clivează un substrat cromogenic – spectrofotometrie. Metoda imunologică: Anticorpi specifici

Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1) Este un reactant de fază acută Sinteza lui e stimulată de nivelele de insulină sau glucoză Crește dupa evenimente trombotice și în sarcină Nu este un test de rutină în clinica medicală

Antiplasmina Plasmina mediază fibrinoliza și antiplasmina inhibă plasmina Factorul XIII activat leagă antiplasmnia la fibrină, protejând-o de fibrinoliză Antiplasmina se leagă și de plasminogen si îl poate împiedica să se lege la fibrină Determinarea antiplasminei nu se face de rutină Valori normale: 48 – 80 mg/dl (metada imunologică); 80 – 130% (metoda funcțională).

Antiplasmina Metoda funcțională: plasmina în exces este adaugata peste plasmă excesul cliveaza un substrat cromogenic, eliberându-l și putând fi detectat prin spectrofotometrie Metoda imunologică: Folosește anticorpi specifici anti-antiplasmină

Antiplasmina Deficit dobândit de antiplasmină: Disfuncție hepatică Terapie trombolitică Consum (CID) Deficit ereditar de antiplasmină: Cantitativ – tip I Calitativ – tip II

FIBRINOLIZA – Teste analitice Determinarea PDF - Produsii de degradare ai fibrinei si fibrinogenului sunt indepartati din circulatie de catre macrofagele din ficat Tehnica: a) Metoda cu latex – Ac anti PDF fixati pe particule de latex se adauga peste plasma pacientului aflata in dilutii diferite N – nu exista precipitare sau apare la dilutii ¼ Hiperfibrinoliza – apare precipitare si la dilutii > 1/5 Precipitare la 1/5 – PDF=10μg/ml; 1/10 - 20 μg/ml, 1/15 - 30μg/ml, 1/20 - 40 μg/ml Metoda putin sensibila si semicantitativa b) ELISA – metoda cantitativa, sensibila N< 5 μg/ml

FIBRINOLIZA – Teste analitice Valori crescute ale PDF: postoperator carcinoame tromboze traumatisme recente hepatopatii nefropatii CID hiperfibrinoliza tratament fibrinolitic

FIBRINOLIZA – Teste analitice Determinarea D dimerilor (D-D sau D-E-D) Apar numai la degradarea fibrinei, nu si a fibrinogenului VPN buna – absenta D dimerilor absenta TVP, TEP VPP slaba – D dimerii pot fi prezenti si la varstnici, postoperator, in sdr inflamatorii Metode: Cu latex – putin sensibila, utila in CID, nu poate exclude TEP, TVP ELISA – f sensibila, utila in diagnosticul TEP, TVP N< 0,5 μg/ml

FIBRINOLIZA – Teste analitice Valori crescute ale D dimerilor: CID fibrinoliza trombembolism tromboza venoasa profunda

Inhibitorii coagularii AT III (antitrombina III) CH II (cofactorul heparinic II) PC (proteina C) PS (proteina S) ICE (inhibitorul caii extrinseci)

Antitrombina III sintetizata in ficat si cel endoteliale inhiba ireversibil factorii IIa, Xa, IX a, XIa, XII a prin formarea de cpx ATIII-F efectul este aplificat de heparina si interactiunea cu GAG (heparan sulfat endotelial)

Antitrombina III Excesul de ATIII – inhiba conversia fibrinogenului in fibrina prin blocarea R pentru fibrinogen ai trombinei Test – alungirea TT, corectabil dupa adm. de sulfat de protamina Deficitul de ATIII – risc de evenimente trombotice (cantitativ/calitativ) Deficit genetic Insuficienta hepatica Consum crescut (CID, TVP, interventii chir) Clearance crescut (doze mari de heparina) Sdr nefrotic (rezistenta la trat anticoagulant poate sugera deficit de ATIII)

Antitrombina III – Metode de determinare Dozare functionala – cromogenica, in prezenta heparinei (activitate de cofactor heparinic) sau in absenta heparinei (activitate antitrombinica progresiva) Masoara capacitatea ATIII de a inhiba IIa sau Xa Plasma pacientului +heparina si trombina + substrat cromogenic. Trombina nelegata cliveaza substratul si elibereaza substanta cromogenica – masurata spectrofotometric (IP cu cantitatea de ATIII)

Antitrombina III – Metode de determinare Dozarea imunologica IDR Electroimunodifuzie Nefelometrie Evalueaza atat ATIII activa cat si cea inactiva (degradata sau legata in cpx) Important de corelat cu testele functionale pentru diferentierea deficitelor cantitative de cele calitative

Antitrombina III – Metode de determinare Valori normale – 170-390mg/l Valori crescute Hepatite acute Medicamente (anticoagulante, penicilina) Valori scazute Fiziologic – nou-nascuti, sarcina, femei in per. fertila Patologic – deficit congenital, CH, HC, contraceptive orale, CID, sdr nefrotic, chimioterapie, tromboze, interventii chirurgicale

Determinarea cofactorului heparinic (CHII) CHII – polipeptid sintetizat in ficat independent de vit K Activat de heparina sau GAG Dozarea functionala Metoda amidolitica – masoara capacitatea CHII de a inhiba IIa in prezenta dermatan sulfatului); activitatea reziduala a trombinei e masurata pe un substrat cromogen Dozarea imunologica – ELISA, imunoelectroforeza, WesternBlot Valori normale – 0,8-1,6 mmol/l sau 80 mg/ml

Determinarea cofactorului heparinic (CHII) Valori scazute: Fiziologic – nou-nascuti (50% din val la adult) Patologic – deficit congenital, CID, AVC, TVP, insuficienta hepatica, pancreatita acuta, transplant renal, talasemii, diabet zaharat

Determinarea proteinei C Sistemul proteinei C e alcatuit din – proteina C, proteina S, trombomodulina PC – glicoproteina sintetizata in ficat in prezenta vitaminei K - se activeaza la fixarea de trombomodulina PCa – inhiba Va si VIIIa prin proteoliza limitata - stimuleaza activarea X si conversia II in IIa (la pacientii cu TVP deficitul de PCa este de 5-10 ori mai frecvent decat cel de ATIII, PC, PS)

Determinarea proteinei C PC circula sub forma inactiva, fiind activata de cpx trombina-trombomodulina la nivelul patului capilar (rap Sendot/Vsange este mare) Lant greu – cu centrul catalitic activ si peptida de activare Lant usor – situsul de legare de PL incarcate negativ (prin intermediul ionilor de Ca) Deficit – cantitativ - calitativ

Determinarea proteinei C Metoda cronometrica Bazata pe aPTT sau TP – masoara act. anticoagulanta a PCa asupra Va si VIIIa Furnizeaza informatii asupra eliberarii peptidei de activare, a situsului activ, interactiunea cu PL si PS Metoda cromogenica Evalueaza PC cu ajutorul unui substrat specific, insa nu poate diferentia deficitul calitativ de cel cantitativ

Determinarea proteinei C Metodele trebuie corelate: - c% prin ambele metode – deficit de eliberare a peptidei de activare sau anomalie a situsului activ – nu poate cliva nici Va, VIIIa si nici peptide sintetice - c% numai prin metoda cronometrica – defect de interactiune cu PL, Ca si PS

Determinarea proteinei C Dozarea imunologica – ELISA, imunoelectroforeza Valori normale – 4-5 mg/ml Valori scazute Fiziologic – nou nascuti, copii sub 14 ani Patologic – deficit congenital, HC, CH, tratament cu antivitaminice K, CID, DZ, HTA

I. Inhibitorii procesului de coagulare 4 I. Inhibitorii procesului de coagulare 4. Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden Activitatea anticoagulantă a proteinei C implică degradarea proteolitică a factorilor V și VIII la nivelul unor reziduuri specifice, cu inactivarea acestora Factorul V Leiden este o mutație punctiformă G1691A (Arg506Glu) Apare la 5% din populația caucaziană Mai exista alte doua mutații activatoare ale factorului V, cauzatoare de rezistență la proteina C

I. Inhibitorii procesului de coagulare 4 I. Inhibitorii procesului de coagulare 4. Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden Metoda funcțională: Proba e diluată 1:5 cu plasma deficientă în factor V Se efectuează APTT pe proba diluată înainte și după adăugarea de PCA PCA prelungește APTT de doua ori la indivizii normali și < 2 la pacienții cu Factor V Leiden Specificitate 100%, sensibilitate 100% Metoda PCR: Se extrage ADN-ul din proba nediluată, necentrifugată Se determină prezența mutației prin tehnici ca PCR-RFLP, TaqMan, etc. Singura care poate determina homo- sau heterozigoția

Determinarea proteinei S PS – glicoproteina sintetizata de endoteliu, MK si ficat in prezenta vit K Activeaza PC si creste afinitatea acesteia pentru PL Forme – 40% libera – forma functionala - 60% legata de C4bBP – forma inactiva

Determinarea proteinei S Deficit – cantitativ – activitatea si concentratia PS sunt reduse - calitativ – activitatea PS este redusa, iar concentratia N sau crescuta Dozarea functionala -met cronometrice – pe baza alungirii aPTT si TP, dupa inactivarea Va de catre cpx PCa-PS -met cromogenice – determinari spectrofotometrice dupa adaugarea de substrat cromogen specific pt trombina) - Met imunologice – ELISA (Ac monoclonali specifici), masurarea C4BP prin met imunofotometrica (Laurell). Testele imunologice se efect numai in cazul in care cele functionale sunt modificate

Determinarea proteinei S Valori scazute -fiziologic – sarcina, nou-nascut -patologic – deficit congenital, boli hepatice, tromboze, CID, LES, anticoagulante orale, deficit vitamina K, sdr nefrotic, neoplazii, inflamatii, interventii chirurgicale

Determinarea inhibitorului caii extrinseci a coagularii (ICE) Glicoproteina plasmatica generata concomitent cu activarea FX pe calea extrinseca Are 2 situsuri de legare a heparinei Sintetizat si stocat de Tr, endoteliu – adm de heparina determina eliberarea de ICE de la acest nivel (heparin –releasable TFPI - TFPI-tissue factor patway inhibitor)

Determinarea ICE Forme – 85-90% stocat in endoteliu, Tr, macrofage - 10-15% circulant – 80% in cpx cu LDL, 10% in cpx cu HDL si 10% sub forma libera Mecanism – inhiba Xa prin legarea de acesta - in prezenta Ca, cpx ICE-X neutralizeaza activitatea catalitica a cpx III-VII - impiedica tromboza la nivelul unei leziuni vasculare dupa formarea trombului

Determinarea ICE Masurarea activitatii ICE cu ajutorul metodelor cu punct final (TFPI, end point activity assay) Capacitatea probei de a neutraliza cantitati cunoscute de VIIa si III in prezenta Xa si se masoara activitatea catalitica reziduala a cpx III-VII Masurarea activitatii anticoagulante (TFPI, coagulant activity cinetic assay) – proba cronometrica - Masurarea efectului anticoagulant exercitat de ICE cu ajutorul TP modificat

Determinarea ICE Masurarea ICE liber - Ac pt situsurile de legare a heparinei Nu poare evalua forma legata de lipoproteine Masurarea ICE total -sensibilitate redusa – metode nevalidate

Cauze dobândite de hipercoagulabilitate – anticorpii antifosfolipidici Sindromul antifosfolipidic – afecțiune autoimună caracterizată prin prezența anticorpilor antifosfolipidici, trombozelor arteriale și/sau venoase și a pierderilor de sarcină repetate Anticorpii antifosfolipidici au semnificație clinică numai în prezența sdr fosfolipidic (sindrom primar sau asociat altor boli autoimune) Anticorpii antifosfolipidici cuprind: anticoagulantul lupic, anticorpii anticardiolipidici și anticorpii cardiolipidici care recunosc molecule țintă specifice (beta 2 glicoproteina I, protrombina, proteina C, proteina S, etc)

Cauze dobândite de hipercoagulabilitate – anticorpii antifosfolipidici Mecanismul - incomplet cunoscut; Ipoteze – activarea plachetelor, activarea celulelor endoteliale şi interacţiunea cu beta2 glicoproteina I ( proteina serică care leagă fosfolipidele anionice de la suprafaţa celulelor endoteliale şi are efect anticoagulant).

Prevalența în populația generala Prevalența în populația cu TV Boala Prevalența în populația generala Prevalența în populația cu TV Deficienta de antitrombina 0,17 1-5 Deficienta de proteina C 0,14 – 0,5 3 - 9 Deficienta de proteina S 0,7 2-8 Protrombina G20210A 2 6 Hiperhomocisteinemie (inhibă anticoagularea, stimulează activarea și agreagarea plachetară, toxicitate directă asupra celulelor endoteliale) 5-10 10-25 Factor V Leiden 5 (Caucazieni) 20-50

CAZ 1 Barbat, 35 ani, victima a unui accident rutier TS (met. Ivy) = 15 min. TQ = 20 sec. INR = 1,9 aPTT = 43 sec TT = 25 sec. Fibrinogen = 102 mg/dL Trombocite = 58.000/mm3 TLCE = 148 min. Monomeri de fibrina = absenti D-dimeri in periferie = prezenti

CAZ 2 Barbat, 50 ani, cu fractura de col femural, operat cu montarea unui surub cu autocompactare. Postoperator se administreaza 40 mg enoxaparina/zi subcutanat profund, pentru prevenirea eventualelor embolii sau procese trombotice. Post administrare aPTT-ul are 40 sec. Se trece la dublarea dozei, urmata de o crestere a aPTT la 48 sec. Alte teste efectuate: TS (met. Ivy) = 6 min. TQ = 18 sec. INR = 1,2 TT = 29 sec. Fibrinogen = 102 mg/dL Trombocite = 58.000/mm3 TLCE = 170 min. Monomeri de fibrina = prezenti