Metabolizmus glukózy v pečeni Mgr. Eva BABUŠÍKOVÁ, PhD. Univerzita Komenského v Bratislave,Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta v Martine

‒ za aeróbnych podmienok kyselina pyrohroznová, GLYKOLÝZA ‒ uvoľnenie energie nahromadenej v glukóze; ‒ postupná degradácia glukózy cestou niekoľkých na seba nadväzujúcich metabolických dráh; ‒ výsledným produktom je: ‒ za aeróbnych podmienok kyselina pyrohroznová, ‒ za anaeróbnych podmienok kyselina mliečna; ‒ organizmus využíva aj glukózu, ktorá vzniká v pečeni z nesacharidových zlúčenín – glukoneogenéza.

Glykolýza ‒ metabolická dráha situovaná v cytoplazme buniek, a) tvorba energie ‒ uvoľnenie len malej časti energie glukózy, ‒ vznik ATP na substrátovej úrovni, b) tvorba intermediátov pre iné metabolické dráhy, ‒ kyselina pyrohroznová, ktorá sa za aeróbnych podmienok mení na acetyl-CoA, cez ktorý sa dostáva do citrátového cyklu, kde sa zvyšná energia glukózy skoncentruje v redukovaných koenzýmoch prenášajúcich elektróny a protóny do procesu terminálnej oxidácie, ‒ základná podmienka pre rozbehnutie glykolýzy: ‒ prenos glukózy z krvi do buniek, ‒prenos do buniek svalu a tukového tkaniva je závislý na prítomnosti inzulínu, ‒ na prenos glukózy do mozgu a pečene inzulín vplyv nemá

Glykolýza Transport glukózy: a) aeróbna glykolýza – bunky s mitochondriami a s dostatočným prívodom kyslíka (O2 – reoxidácia NADH) – kyselina pyrohroznová – konečný produkt – oxidačná dekarboxylácia kyseliny pyrohroznovej na acetyl CoA → KC b) anaeróbna glykolýza – bunky bez mitochondrií (Ery) a s nedostatočným prívodom kyslíka – tvorba kyseliny mliečnej (reoxidácia NADH) Transport glukózy: a) uľahčená difúzia – po koncentračnom spáde – transportéry pre GLU (GLUT 1-5) – vysoká homológia v primárnej štruktúre, tkanivovo špecifická expresia GLUT – 1 – Ery GLUT – 4 – tukové tkanivo, sval (inzulín počtu a aktivity) b) kotransport – proti koncentrčnému spádu – kotransport s Na+ – epiteliálne bunky čreva, renálny tubul, plexus chorioideus

Glykolýza Metabolickú dráhu glykolýzy môžeme rozdeliť na dve fázy: Prvá fáza glykolýzy – spotreba energie: a) tvorba fosforylovaných foriem sacharidov (- 2 ATP), b) tvorba 2 trióz , reakcie 1 – 5 Druhá fáza glykolýzy – produkcia energie: a) tvorba 4 ATP , b) tvorba 2 NADH, c) tvorba 2 molekúl kyseliny pyrohroznovej. reakcie 6 – 10

Glykolýza – cytoplazma Pentózový cyklus – cytoplazma Krebsov cyklus – mitochondrie Dýchací reťazec – vnútorná membrána motochondrie Oxidatívna fosforylácia – matrix mitochondrie

Glykolýza glukóza glukóza-6-P fruktóza-6-P fruktóza-1,6-P ATP ATP – enzýmy fosfokinázy: prenos kyseliny fosforečnej z ATP na substráty, alebo zo substrátu na ADP – fosfofruktokináza – najdôležitejší enzým v procese glykolýzy – katalyzuje vznik fruktóza-1,6-bisfosfátu – regulačný enzým – aktiváciou alebo inhibíciou enzýmu, podľa požiadaviek tkanív sa urýchľuje alebo spomaľuje tvorba kyseliny pyrohroznovej

Glykolýza 1. reakcia: fosforylácia glukóza → glukóza-6-fosfát – glukóza-6-fosfát neprechádza membránou, hexokináza – regulačný enzým, rôzne tkanivá, fosforylácia hexóz, – inhibícia: glukóza-6-fosfátom, vysokým pomerom ATP/ADP, – nízka Km, glukokináza – pečeň a ß bunky pankreasu, – fosforylácia glukózy v postresorpčnej fáze, – ↑ hladiny po príjme sacharidov a vyplavení inzulínu, – neinhibuje ju glukóza-6-fosfát, – vysoká Km. 2. reakcia: izomerizácia glukóza-6-fosfát ↔ fruktóza-6-fosfát glukóza-6-fosfátizomeráza (fosfoglukózaizomeráza)

Glykolýza 3. reakcia: ireverzibilná fosforylácia fruktóza-6-fosfát → fruktóza-1,6-bisfosfát fosfofruktokináza 1 (PFK 1) – rýchlosť limitujúca reakcia, – regulačné miesto. Regulácia: energetický stav bunky, a) ↑ hladina ATP a ↑ hladina citrátu → - PFK 1, b) ↑ hladina AMP → + PFK 1, c) fruktóza-2,6-bisfosfát a) silný aktivátor PFK 1, b) inhibítor fruktóza-1,6-bisfosfatázy (glukoneogenéza), – recipročný účinok na glykolýzu a glukoneogenézu, – metabolizmus: 1. vznik → fosfofruktokináza 2 (PFK 2), 2. degradácia → fruktózabisfosfatáza 2 (FBF 2), – kinázová a fosfatázová aktivita – 2 domény v jednej bifunkčnej molekule enzýmu

1. 2.

3.

5. reakcia: izomerizácia Glykolýza 4. reakcia: štiepenie fruktóza-1,6-bisfosfát ↔ glyceraldehyd-3-fosfát+ dihydroxyacetónfosfát aldoláza A 5. reakcia: izomerizácia dihydroxyacetónfosfát ↔ glyceraldehyd-3-fosfát triózafosfátizomeráza

4. 5.

Glykolýza – premena fruktóza-1,6-bisfosfátu (6 C, 2 P) na 2 triózy (3 C, 1 P) – počas premeny triózy na kyselinu pyrohroznovú vznikajú na dvoch miestach medziprodukty, na ktorých je viazaná kyselina fosforečná makroergickou väzbou – dostatočne veľkou na vytvorenie ATP substrátová fosforylácia – prenos kyseliny fosforečnej na ADP

Glykolýza – v priebehu oxidačnej reakcie v 2. fáze glykolýzy sa vytvorí redukovaný NADH+ + H+ – v aeróbnych podmienkach sa môže odovzdať vodíky do terminálnej oxidácie, čím sa vytvoria podmienky pre vznik troch ATP (na jednu triózu) v procese oxidatívnej fosforylácie – v anaeróbnych podmienkach sa vodíky z redukovaného NADH+ + H+ prenášajú na kyselinu pyrohroznovú – výsledným produktom glykolýzy je tak kyselina mliečna laktátdehydrogenáza

6. reakcia: oxidácia glyceraldehyd-3-P → 1,3-bisfosfoglycerát Glykolýza 6. reakcia: oxidácia glyceraldehyd-3-P → 1,3-bisfosfoglycerát glyceraldehyd-3-P-dehydrogenáza – koenzým NAD+ a) oxidácia NADH → premena kyseliny pyrohroznovej na kyselinu mliečnu b) oxidácia NADH v dýchacom reťazci – substrátová fosforylácia – oxidácia aldehydovej skupiny → karboxylová skupina – naviazanie fosfátui makroergickou väzbou - syntéza 2,3-bisfosfoglycerátu (2,3-BFG) bisfosfoglycerátmutáza: vysoká hladina v Ery rozklad: fosfatáza → 3-fosfoglycerát

kyselina 1,3-bisfosfoglycerová ↔ kyselina 3-fosfoglycerová Glykolýza 7. reakcia: vznik ATP kyselina 1,3-bisfosfoglycerová ↔ kyselina 3-fosfoglycerová fosfoglycerátkináza – 2 molekuly ATP 8. reakcia: vnútromolekulový presun fosfátu kyselina 3-fosfoglycerová ↔ kyseliny 2-fosfoglycerová fosfoglycerátmutáza 9. reakcia: dehydratácia kyselina 2-fosfoglycerová ↔kyselina fosfoenolpyrohroznová enoláza – presun energie v rámci molekuly – vznik enolfosfátovej väzby

– tvorba ATP substrátovou fosforyláciou – feed-forward regulácia Glykolýza 10. reakcia: vznik ATP kyselina fosfoenolpyrohroznová→ kyselina pyrohroznová pyruvátkináza – 2 molekuly ATP – tvorba ATP substrátovou fosforyláciou – feed-forward regulácia pečeň: fruktóza-1,6-bisfosfát aktivuje pyruvátkinázu (spojenie 2 kinázových aktivít: ↑ fosfofruktokináza 1 → ↑ pyruvátkináza) – kovalentná modifikácia pyruvátkinázy – fosforylácia – cAMP dependentná proteínkináza – pečeň: ↑ glukagón (nízka hladina glukózy) → ↑c AMP → fosforylácia → fosforylovaná proteínkináza (inaktívna) – defosforylácia: fosfatáza → proteínkinázy (aktívna) – kyselina fosfoenolpyrohroznová – vstup do glukoneogenézy

6. ! 7. ERY: HbO2 + 2,3-BPG → → Hb-2,3-BPG + O2

8. 9. ! Pečeň 10.

Metabolizmus glukózy v pečeni GLUT 2 PEČEŇ GLU GLUKÓZA PC GLU 6 GLYKOGÉN P GLUKURONIDY PYRUVÁT LAKTÁT ACETYL CoA H+ TUKY TCA ATP

Metabolizmus glukóza-6-P v erytrocyte

Premena kyselina pyrohroznová → kyselina mliečna laktátdehydrogenáza (LD) a) anaeróbna glykolýza v eukaryotických bunkách b) Ery, Leu, šošovka, rohovka, dreň obličky, testes 1. vznik kyseliny mliečnej vo svale – počas námahy, produkcia energie za anaeróbnych podmienok – ↑ produkcia NADH (glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza) + Krebsov cyklus – ↓pH → bolesti svalu – kyselina mliečna do krvi 2. spotreba kyseliny mliečnej – opačný účinok laktátdehydrogenázy – pečeň: a)Lac → Pyr → Glu (glukoneogenéza) b)Lac → Pyr → Krebsov cyklus – myokard: Lac → Pyr → Krebsov cyklus

Premena kyseliny mliečnej 1. oxidatívna dekarboxylácia kyseliny mlečnej – pyruvátdehydrogenáza (komplex) – vznik acetyl-CoA 2. karboxylácia kyseliny mliečnej – pyruvátkarboxyláza – vznik oxálacetátu 3. redukcia kyseliny mliečnej na etanol (mikroorganizmy) a) dekarboxylácia pyruvátu – pyruvátdekarboxyláza b) redukcia acetaldehydu na etanol

PYRUVÁT DEHYDROGENÁZOVÝ KOMPLEX LAKTÁTDEHYDROGENÁZA dôležitá v RBC, WBC (a iných bunkách s/bez mitochondrií) a v kostrovom svale počas kontrakcie) fyziologicky reverzibilná v tkanivách s ↓ NADH /NAD+, napr. pečeň, srdcový sval lokalizovaná v cytosole SYNTÉZA ETANOLU vyskytuje sa u kvasiniek, niektorých baktérií (vrátane črevnej flóry) dráha závislá od tiamín pyrofosfátu lokalizovaná v cytosole CO2 Etanol Acetaldehyd PYRUVÁT Laktát (Thiamine-PP) NAD+ NADH + H+ NADH + H+ NAD+ CO2 NAD+ CO2 NADH + H+ Oxálacetát Acetyl-CoA PYRUVÁTKARBOXYLÁZA biotín sa využíva ako prostetická skupina aktivovaný acetyl CoA v pečeni dopĺňa medziprodukty cyklu TCA poskytuje substráty pre glukoneo-genézu ireverzibilná reakcia lokalizovaná v mitochondriách PYRUVÁT DEHYDROGENÁZOVÝ KOMPLEX tiamín-PP, kyselina lipoová, FAD, NAD+ a CoA sa využívajú ako koenzýmy zdroj acetyl CoA pre TCA a syntézu mastných kyselín ireverzibilná reakcia lokalizovaný v mitochondriách

Energetická bilancia glykolýzy: 1. anaeróbna glykolýza Glu + 2 Pi + 2 ADP → 2 Lac + 2 ATP + 2 H2O a) tvorba ATP – 2 molekuly ATP na 1 molekulu glukózy – malý energetický zisk – bunky a tkanivá bez, resp. s malým množstvom mitochondrií: Ery, Leu, k. dreň, obličky b) tvorba NADH – nie je čistý zisk – 1x NADH + (glyceraldehyddehydrogenáza) – 1x NADH - (laktátdehydrogenáza)

Glu + 2 Pi + 2 NAD+ + 2 ADP → 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O 2. aeróbna glykolýza Glu + 2 Pi + 2 NAD+ + 2 ADP → 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O – spotreba 2 ATP (fosforylačné reakcie) – tvorba 4 ATP (2 x 2 ATP) – čistý zisk 2 ATP – 2 x NADH → 6 ATP (3 ATP/ NADH v Krebsovom cykle) Porovnanie zisku energie – z glukózy po vytvorení kyseliny mliečnej glykolýza: 2 ATP (na substrátovej úrovni) – pri spálení glukózy na CO2 a H2O v aeróbnom prostredí glykolýza + citrátový cyklus + terminálna oxidácia: 38 ATP (z nich 34 oxidatívnou fosforyláciou)

Regulácia glykolýzy krátkodobá (min resp. h) – alosterická aktivácia / inhibícia – fosforylácia / defosforylácia dlhodobá (hodiny – dni) – hormonálna (inzulín, glukagón) – 10 – 20x zvýšenie enzýmovej aktivity regulačné enzýmy a) glukokináza b) fosfofruktokináza c) pyruvátkináza

– kľúčový regulačný enzým: fosfofruktokináza Regulácia glykolýzy – kľúčový regulačný enzým: fosfofruktokináza – katalyzuje premenu fruktóza-6-fosfátu na fruktóza-1,6-bisfosfát – rýchlosť metabolickej dráhy glykolýzy bude závisieť predovšetkým od energetického náboja bunky – ak má bunka dostatok ATP → tvorba kyseliny pyrohroznovej sa znižuje – vysoká koncentrácia ATP alostericky znižuje aktivitu fosfofruktokinázy – vysoká koncentrácia AMP → signálom pre urýchlenie glykolýzy (ATP sa spotrebovala na krytie energetických požiadaviek organizmu) – AMP je alosterický aktivátor fosfofruktokinázy

– aktivitu fosfofruktokinázy, a tým urýchlenie spaľovania glukózy, podstatne zvyšuje alostericky fruktóza-2,6-bisfosfát – vysoká koncentrácia glukózy v krvi – vyplavenie inzulínu – inzulín urýchľuje: a) prienik glukózy do buniek b) glykolýzu cez fruktózu-2,6-bisfosfát – nízka koncentrácia glukózy v krvi – z pankreasu vylúčený glukagón – glukagón spomaľuje glykolýzu cez fruktóza-2,6-fosfát (chránenie nízkeho obsahu glukózy v krvi pre činnosť mozgu) – obe premeny vedú k návratu glykémie k norme

Klinická aplikácia 1. Vrodený nedostatok enzýmov glykolýzy a) pyruvátkináza (95%) b) fosfoglukózaizomeráza (4%) – rozdielna expresia v bunkách a tkanivách – pyruvátkináza – Leu, Ery – triózafosfátizomeráza – Ery, Leu, sval, CNS Prejavy: hemolytická anémia Terapie: bez terapie resp. kyselina listová 2. Laktátová acidóza – anaeróbna glykolýza – produkcia energie pri nedostatku kyslíka (IM, pľúcna embólia, krvácanie) – kyselina mliečna v krvi – informácia o „kyslíkovom dlhu“ – posúdenie závažnosti šoku – monitorovanie liečby a rekonvalescencie

– rozpad zásob uložených v podobe glykogénu, Glukoneogenéza – nedostatok glukózy v potrave – zníženie koncentrácie glukózy v krvi. – snaha nahradiť glukózu v krvi z interných zdrojov. – potrebný kontinuálny prívod glukózy – mozog, Ery, dreň obličiek, šošovka, rohovka, testes, pracujúci sval. Dva mechanizmy: – rozpad zásob uložených v podobe glykogénu, – novotvorba glukózy z nesacharidových zdrojov. – glukoneogenéza situovaná 90 % v pečeni a 10 % v obličke pri dlhodobom hladovaní – základné nesacharidové substráty (alfa-oxokyseliny, glycerol, kyselina mliečna) – cez kyselinu pyrohroznovú – vstup do reakcií veľmi podobným glykolýze

Glukoneogenéza – vratné reakcie glukoneogenézy katalyzujú tie isté enzýmy ako vratné reakcie v glykolýze, – enzýmy, ktoré katalyzujú nevratné reakcie v glykolýze (fosfokinázy) sú v glukoneogenéze nahradené enzýmami s opačným účinkom (fosfatázy), – mimoriadny význam má glukóza-6-fosfatáza – umožňuje prechod glukózy z buniek do krvi. Proces glukoneogenézy urýchľuje glukagón a opačný účinok má inzulín. Proces glukoneogenézy sa zvyšuje pri inhibícii enzýmov glykolýzy.

Metabolická dráha glukoneogenézy: – glukoneogenéza nie je reverzibilná glykolýza – tri reakcie sú ireverzibilné: 1. premena kyseliny fosfoenolpyrohroznovej na kyselinu pyrohroznovú pyruvátkináza a) kyseliny pyrohroznová – karboxylácia → kyselina oxaloctová pyruvátkarboxyláza (mitochondrie – pečeň, dreň obličiek) koenzým: biotín; aktivácia – acetyl-CoA b) kyselina oxaloctová → kyseliny fosfoenolpyrohroznová fosfoenolpyruvátkarboxykináza (cytoplazma) kyseliny oxaloctová – transport z mitochondrie do cytoplazmy – malát – reoxidácia na kyselinu oxaloctovú

2. defosforylácia fruktóza-1,6-bisfosfátu fruktóza-1,6-bisfosfatáza – nevratná reakcia: fosfofruktokináza 1 (glykolýza) – regulačné miesto: a) energetický stav bunky + ↓ AMP; ↑ ATP – ↑ AMP b) regulácia fruktóza-2,6-bisfosfátom – inhibícia fruktóza-1,6-bisfosfatázy alostericky 3. defosforylácia glukóza-6-fosfátu glukóza-6-fosfatáza – lokalizácia: pečeň, obličky Sumárna reakcia 2Pyr + 4ATP + 2GTP + 2NADH + 2H+ + 6H2O → Glu + 2NAD+ + 4ADP + 2GDP + 6Pi + 6H+

Glukóza-6-fosfát Glukóza Glukóza-6-fosfatáza Glukóza-6-fosfát Glukóza Fruktóza-6-P Fruktóza-1,6-bisfosfatáza Fruktóza-1,6-bisfosfát Glyceraldehyd-3-P Dihydroxyacetónfosfát Kyselina 1,3-bisfosfoglycerová Kyselina 3-fosfoglycerová Kyselina 2-fosfoglycerová Kyselina fosfoenolpyrohroznová Pyruvát Kyseliny mliečna Fosfoenolpyruvát- Pyruvátkarboxyláza (MIT) karboxykináza (CYT) Kyselina oxaloctová CO2

Glukoneogenéza Substráty pre glukoneogenézu: 1. glycerol – produkt lipolýzy (TAG) v tukovom tkanive – transport do pečene – fosforylácia → glycerolfosfát (oxidácia) → dihydroxyacetónfosfát 2. kyselina mliečna Coriho cyklus – glukóza (pečeň)→ krv → sval → kyselina mliečna (krv) → pečeň (glukoneogenéza) 3. α-ketokyseliny – pyruvát, oxalacetát, alfa-ketoglutarát – glukogénne aminokyseliny – Ala, Ser, Gly, Cys, Thr (pyruvát); Asp (oxalacetát); Glu (alfa-ketoglutarát)

Coriho a glukóza-alanínový cyklus

Regulácia glukoneogenézy Glukagón – stimulácia glukoneogenézy a) znižuje hladinu fruktóza-2,6-bisfosfátu – aktivácia fruktóza-1,6-bisfosfatázy – inhibícia fosfofruktokinázy 1 (glykolýza) b) kovalentná modifikácia enzýmovej aktivity – cAMP → aktívna proteínkináza A → inaktívna pyruvátkináza (P) => hromadenie kyseliny fosfoenolpyrohroznovej Dostupnosť substrátov ↓ inzulínu → mobilizácia proteínov → glukogénne AK Alosterická aktivácia acetyl-CoA ↑ acetyl CoA → stimulácia pyruvátkarboxylázy (pečeň)

Aktivácia viacerých enzýmov Glukagón (↓) Inzulín (↑) receptor Bunková membrána Bunková membrána Adenylát -cykláza Aktivácia viacerých enzýmov ATP cAMP 2. Znížená aktivita proteín-kinázy A uprednostňuje defosforylovanú formu FFK-2 / FBF-2 komplexu 1. Vysoký pomer inzulín / glukagón spôsobuje pokles cAMP a znižuje hladiny aktívnej proteínkinázy A Aktívna proteínkináza A (↓) FBF-2 = fruktózabisfosfát- fosfatáza-2 FFK-2 = fosfofruktokináza-2 Fruktóza- 6-fosfát ATP ADP P P ATP FFK-2 inakt. FBF-2 inakt. FBF-2 akt. FFK-2 akt. Fosfofruktokináza-2 Pi ADP + Fruktóza-2,6-bisfosfát (↑) 4. Zvýšená koncentrácia fruktóza 2,6-bisfosfátu aktivuje FFK 1, ktorá vedie k zvýšenej rýchlosti glykolýzy Fruktóza-1,6-bisfosfát 3. Defosforylovaná FFK-2 je aktívna, zatiaľ čo FBF-2 je inaktívna; čo uprednostňuje tvorbu fruktóza 2,6-bisfosfátu

Glukagón (↑) Inzulín (↓) receptor Bunková membrána Bunková membrána Adenylát -cykláza ATP cAMP + PPi 2. Zvýšená aktivita proteín-kinázy A uprednostňuje fosforylovanú formu FFK-2 / FBF-2 komplexu 1. Nízky pomer inzulín / glukagón spôsobuje pokles cAMP a zvyšuje hladiny aktívnej proteínkinázy A; pyruvátkináza-P inaktívna Aktívna proteínkináza A (↑) FBF-2 = fruktózabisfosfát- fosfatáza-2 FFK-2 = fosfofruktokináza-2 Pi Fruktóza-6-fosfát ATP ADP P Pi P FFK-2 akt. FBF-2 akt. FBF-2 inakt. FFK-2 inakt. Fruktózabisfosfátfosfatáza-1 Pi H2O - Fruktóza-2,6-bisfosfát (↓) 4. Znížená koncentrácia fruktóza 2,6-bisfosfátu spomaľuje aktiváciu FFK 1, čo vedie k zvýšenej rýchlosti glukoneogenézy Fruktóza-1,6-bisfosfát 3. Fosforylovaná FFK-2 je inaktívna, zatiaľ čo FBF-2 je aktívna; čo bráni tvorbe fruktóza 2,6-bisfosfátu