Άσκηση 11 Κυτταρομετρία Ροής Ρ. Τσιτσιλώνη Λ. Φωτεινοπούλου Π. Παπαζαφείρη

Η έννοια του φθορισμού έμμεσος ανοσοφθορισμός Φθορισμός: η εκπομπή φωτός ορισμένου μήκους κύματος από ουσίες που ακτινοβολούνται με φως μικρότερου μήκους κύματος. Φθοριοχρώματα: μόρια που απορροφούν ακτινοβολία υψηλής ενέργειας, διεγείρονται, τα ηλεκτρόνιά τους μετακινούνται σε ανώτερη ενεργειακή τροχιά, επανέρχονται στην αρχική κατάσταση εκπέμποντας ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος από τη διεγείρουσα. άμεσος ανοσοφθορισμός έμμεσος ανοσοφθορισμός

Τα CD (cluster of differentiation) μόρια Bοηθητικό Τ λεμφοκύτταρο: CD45+ CD3+ TCR+ CD4+ NK κύτταρο: CD45+ CD3- TCR- CD16+

+ + = Flow Cytometry Definition of Flow Cytometry metry ~ measure cyto ~ cell + metry ~ measure flow ~ in motion + = Flow Cytometry Measure the properties of single cells in a flowing system = analyze many properties of many cells in very little time

From Pulse Cytophotometry to CyTOF 1965 3-4 colors 6-8 colors 18 colors >>40 colors

Το FACS του Τομέα μας (CANTO II, BD)

Η ανάλυση των δειγμάτων

Η αρχή της μεθόδου λεμφοκύτταρα σημασμένα με φθορίζοντα mAb

Σήμανση με ένα αντίσωμα ιστογράμματα

Σήμανση με δύο αντισώματα ιστογράμματα

Σήμανση με δύο αντισώματα στικτόγραμμα CD3-CD8+ CD3+CD8+ CD3-CD8- CD3+CD8-

Xρησιμοποιούμενα φθοριοχρώματα

Συνδυασμοί mAb για τον έλεγχο ρουτίνας ατόμων με HIV λοίμωξη FITC PE Χρησιμότητα 1. CD45 CD14 Καθορισμός παραθύρων (CD45+CD14-) 2. Ισότυπος IgG1 Ισότυπος ΙgG2 Τοποθέτηση δεικτών 3. CD3 CD4 μέτρηση Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων 4. CD3 CD8 μέτρηση Τ κυτταροτοξικών λεμφ. 5. CD3 CD16/CD56 μέτρηση NK κυττάρων 6. CD3 CD19 μέτρηση B λεμφοκυττάρων Διπλός ανοσοφθορισμός Συνδυασμοί Χρησιμότητα 1. CD3/CD4/CD45 μέτρηση Τ και Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων 2. CD3/CD8/CD45 μέτρηση Τ και Τ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων 3. CD3/CD19/CD45 μέτρηση Τ και Β λεμφοκυττάρων 4. CD3/CD16/CD45 μέτρηση ΝΚ κυττάρων Τριπλός ανοσοφθορισμός Συνδυασμοί Χρησιμότητα 1. CD3/CD4/CD8/CD45 μέτρηση Τ, Τ βοηθητικών και Τ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων 2. CD3/CD19/CD16/CD45 μέτρηση Τ, ΝΚ και Β λεμφοκυττάρων Τετραπλός ανοσοφθορισμός

NGF: Cell Analysis & Data Interpretation

Examples of diphenotypic MRD+ cases Normal PCs; Clone 1; Clone 2 CD19-CD56+CD45dimCD27-CD38+/dimCD138hiCD117+ CD81-kappa (63,5%) CD19-CD56-CD45dimCD27-CD38+/dimCD138dim/+CD117+CD81-kappa (36,5%) CD19-CD56+CD45dimCD27-CD38+CD138hiCD117+ CD81-lambda (29,4%) CD19-CD56-CD45dimCD27-CD38+CD138hiCD117+ CD81-lambda (70,6 %) CD19_CD56+CD45dimCD27dimCD38+CD138hiCD117-/dimCD81_kappa (65,3%) CD19+CD56+CD45dimCD27dim CD38+CD138hiCD117-/dimCD81hetkappa (34,7%)

NGF: Cell Acquisition = 5 x 106 / tube Aberrant plasma cells; Normal plasma cells 50 clonal cells detected 5,000,000 cells recorded 8 clonal cells detected 1,000,000 cells recorded 3 clonal cells detected 500,000 cells recorded

Ενδοκυτταρική χρώση

Διαχωρισμός κυττάρων (sorting)

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί Για το φυλλάδιό σας 11% 42% 31% 0% Anti-CD3-FITC Anti-CD4-PE Για το κάθε στικτόγραμμα χωριστά: Ποσοστό Τ λεμφοκυττάρων ? Ποσοστό Τh λεμφοκυττάρων ? Ποσοστό Τc λεμφοκυττάρων ? Ποσοστό ΝΚ κυττάρων ? Υποπληθυσμοί με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά? Anti-CD56-PE Anti-CD3-FITC 11% 66% 4%