ΑΣΚΗΣΗ 9 ΑΙΜΟΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ Πατήστε Esc να κλείσει η προβολή

ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ

Συγκόλληση ονομάζεται η ορατή αντίδραση, που παρατηρείται όταν εναιωρήματα σωματιδιακών αντιγόνων (ερυθροκυττάρων ή βακτηρίων) αναμιγνύονται με αντιορούς οι οποίοι περιέχουν ομόλογα αντισώματα. Εξαιτίας της πολυδύναμης φύσης τόσο των αντιγόνων (περισσότεροι του ενός αντιγονικοί επίτοποι), όσο και των αντισωμάτων, οι αντιδράσεις συγκόλλησης χαρακτηρίζονται από το σχηματισμό τρισδιάστατου πλέγματος που δημιουργείται κατά τρόπο ανάλογο με εκείνον του σχηματισμού ανοσοϊζήματος μεταξύ διαλυτών αντιγόνων και ομολόγων αντισωμάτων.

ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ

Οι δοκιμασίες συγκόλλησης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ΠΟΙΟΤΙΚΟ και ΗΜΙΠΟΣΟΤΙΚΟ προσδιορισμό αντισωμάτων. Στη δεύτερη περίπτωση προσδιορίζεται ο τίτλος των αντισωμάτων, ο οποίος αντιστοιχεί στη μέγιστη αραίωση με θετικό αποτέλεσμα (ορατή συγκόλληση).

Ομάδα Α: ημέρα 0: ενίονται 2x108 SRBC/αρουραίο ενδοπεριτοναϊκά   ημέρα 5: λήψη αίματος Ομάδα B: ημέρα 7: ημέρα 14:

Σε όλες τις σειρές εκτός των Β και Ε προσθέτω 25 λ PBS Στη θέση Α1 προσθέτω 25 λ φυσιολογικού ορού αρουραίου Στις θέσεις C1 και D1 προσθέτω 25 λ ορού μια φορά ανοσοποιημένου (ομάδα Α) Στις θέσεις F1 και G1 προσθέτω 25 λ ορού 2 φορές ανοσοποιημένου (ομάδα Β) Το περιεχόμενο των φρεατίων A1, C1, D1, F1 G1 αραιώνεται με υποδιπλάσιες διαδοχικές αραιώσεις μεταφέροντας 25 λ στις θέσεις A2, C2, D2, F2, G2, μέχρι και τις θέσεις A12, C12, D12, F12, G12. Στις σειρές D και G προσθέτω 25 λ μερκαπτοαιθανόλης, ενώ στις υπόλοιπες προσθέτω 25 λ PBS. Σε όλες τις σειρές εκτός των Β και Ε προσθέτω 25 λ SRBCs.

ΑΡΑΙΩΣΕΙΣ 2 4 8 16 32 64 128 ………………….. ΑΙΜΟΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ

Α: Φυσιολογικός ορός αρουραίου C: Oρός αρουραίου με 1 ανοσοποίηση D: όπως το C + μερκαπτοαιθανόλη F: Oρός αρουραίου με 2 ανοσοποιήσεις G: όπως το F + μερκαπτοαιθανόλη Η: μόνον SRBC

ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΑΣΚΗΣΗ 10 ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ

σΤο σύστημα του συμπληρώματος ενεργοποιείται με δύο τρόπους: α) την κλασσική οδό και β) την εναλλακτική οδό. Και οι δύο οδοί ενεργοποίησης, όταν αυτή συμβαίνει στην επιφάνεια κυττάρων, καταλήγουν στη διάβρωση της μεμβράνης και την κυτταρική λύση. Η ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος είναι ενζυμική σειρά αντιδράσεων, στην οποία το προϊόν κάθε αντίδρασης ενεργοποιεί την επόμενη.

Σημαντικές λειτουργίες του συμπληρώματος είναι: Προσκόλληση, μέσω υποδοχέων C3b πολλών κυτταρικών τύπων, όπως ερυθροκυττάρων, ουδετερόφιλων, βασεόφιλων, λεμφοκυττάρων και δενδριτικών κυττάρων. Αναφυλατοξική δραστικότητα με τη μεσολάβηση των συστατικών C3a και C5a, που προκαλούν την έκλυση μεσολαβητών και ενζύμων από βασεόφιλα και ιστιοκύτταρα. Χημιοταξία με τη μεσολάβηση των συστατικών C3a και C567.

ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΟ + COMPLEMENT Abs ΛΥΣΗ

ΛΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ MAC

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ   Δοκιμαστικοί σωλήνες 1 2 3 4 5 6 7 Βαρβιτουρούχος φυσιολογικός ορός (ml) 1,10 1,05 1,00 0,90 0,80 1,20 -- Απεσταγμένο νερό Ορός κουνελιού ως πηγή συμπληρώματος ml 0,10 0,15 0,20 0,30 0,40 0,00 Εναιώρημα ευαισθητων SRBC (ml)

2) Οι σωλήνες επωάζονται στους 37°C για 30 λεπτά 3) Στη συνέχεια τοποθετούνται σε πάγο για 5 λεπτά. 4) Σε κάθε σωλήνα προσθέτω 2 ml βαρβιτουρούχου φυσιολογικού ορού. 5) Φυγοκεντρώ τους σωλήνες 1-6, στις 3.000 στροφές για 5 λεπτά. 6) Μηδενίζω το φωτόμετρο με βαρβιτουρούχο φυσιολογικό ορό. 7) Από κάθε σωλήνα παίρνω δείγμα υπερκείμενου και φωτομετρώ στα 540 nm.

Εκτίμηση των αποτελεσμάτων 1)Αποδεχόμενοι ότι το υπερκείμενο υγρό του δοκιμαστικού σωλήνα Νο 7, δίνει οπτική πυκνότητα, η οποία αντιστοιχεί στη λύση όλων των ερυθροκυττάρων, αξιολογούνται οι τιμές οπτικής πυκνότητας που προέκυψαν από κάθε υπερκείμενο υγρό, καθώς και η % λύση των ερυθροκυττάρων σε κάθε σωλήνα. 2) Ο προσδιορισμός του CH50 γίνεται με τη βοήθεια γραφικής παράστασης, με συντεταγμένες (Χ, Ψ) τον όγκο του συμπληρώματος (σε ml) και την % λύση των ερυθροκυττάρων, αντίστοιχα.

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ % ΛΥΣΗΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ % ΛΥΣΗ = OD ΔΕΊΓΜΑΤΟΣ- OD ΣΩΛΗΝΑ 6 OD ΣΩΛΗΝΑ 7- OD ΣΩΛΗΝΑ 6 Χ 100 ΘΕΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ

ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ C50 ??