Μ.Δ.Ε: « Εφαρμογές της Βιολογίας στην Ιατρική» Μάθημα: Μοριακή Βιολογία: Αρχές και Μεθοδολογία Η τεχνολογία RNAi (RNA interference) ως ένα ισχυρό επεμβατικό εργαλείο για τη λειτουργική αδρανοποίηση επιλεγμένων γονιδίων στόχων Ανδριανή Γ. Παράσχη Α.Μ: 294114 Υπεύθυνος Καθηγητής: Γεώργιος Κ. Ροδάκης Ιούνιος 2009
RNAi (RNA interference) Φυσικός αμυντικός μηχανισμός Εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία Σημαντικό εργαλείο της βιοτεχνολογίας και της βιοιατρικής
1998-Fire et al. : πρώτοι περιέγραψαν το φαινόμενο RNAi στο C 1998-Fire et al.: πρώτοι περιέγραψαν το φαινόμενο RNAi στο C.elegans εισάγοντας dsRNA Ιστορική αναδρομή 2001- Tuschl T and colleagues : περιέγραψαν τo RNAi στα θηλαστικά 2003- Song et al.: πρώτοι αναφέρουν ότι τα siRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για θεραπεία σε όλα τα ζώα 2004- Acuity Pharmaceuticals: πρώτη φάση κλινικής δοκιμής του siRNA ως φάρμακο για age-related macular degeneration (AMD) 2006-Andrew Fire and Craig Mello: Nobel Prize in Physiology or Medicine για την ανακάλυψη του RNAi μηχανισμού
Ιστορική αναδρομή Nobel Prize in Physiology or Medicine (2006): Andrew Fire and Craig Mello
μηχανισμός εισαγωγή δίκλωνου μεγάλου μήκους RNA (dsRNA) κόβεται από το ένζυμο Dicer (RNase III) ενσωματώνονται στο σύμπλεγμα RISC υβριδισμός με το RNA - στόχο αποικοδόμηση δεν μπορεί να γίνει σύνθεση πρωτεΐνης
siRNAs (Small Interfering RNAs) Δίκλωνα μόρια Μήκους 21-23 νουκλεοτιδίων Seed region Εξαρτάται από το όργανο-στόχος, το γονίδιο-στόχος και το είδος
miRNAs, piRNAs, esiRNAs Micro-RNAs (miRNAs) Μονόκλωνα μόρια Μήκους 21 νουκλεοτιδίων μηχανισμός Drosha (RNaseIII) μήκους 70 νουκλεοτιδίων Exportin-5 στο κυτόπλασμα Dicer miRNAs βαθμός της ομολογίας α)μη αντιστρεπτή διάσπαση β)μερική καταστολή της μετάφρασης
miRNAs, piRNAs, esiRNAs piRNAs esiRNAs Piwi proteins Μήκους 24-30 νουκλεοτιδίων Γαμετικά κύτταρα Πιθανόν να παίζουν ρόλο στην σπερματογένεση rasiRNAs (repeat-associated short interfering RNAs) τροποποίηση χρωματίνης esiRNAs Προέρχονται από ρετρο-μεταθετά στοιχεία και πιθανόν αποτελούν αναστολείς τους
Παράγοντες που επηρεάζουν τον βαθμό αποσιώπησης των siRNAs Η δραστικότητα διαφορετικών μορίων siRNAs ενάντια στο ίδιο mRNA-στόχο ποικίλει εξαρτάται: α) ενδογενείς παράγοντες του siRNA Οι δυο αλυσίδες του siRNA ( ή του miRNA) δεν συνδέονται τυχαία στο σύμπλεγμα RISC επιλέγεται η αλυσίδα με τη μικρότερη θερμοδυναμική σταθερότητα στο 5΄ άκρο μεγαλύτερο ποσοστό A/T β) χαρακτηριστικά του mRNA-στόχου Ευκολία πρόσβασης στην περιοχή σύνδεσης
Παράγοντες που επηρεάζουν τον βαθμό αποσιώπησης των siRNAs 1) η σχετική σταθερότητα των δυο άκρων ενσωμάτωση στο RISC 2) η προσβασιμότητα του mRNA τον βαθμό αποσιώπησης
Χημικές τροποποιήσεις In vivo: τροποποίηση των siRNAs Προστασία από νουκλεάσες Αυξάνουν τον χρόνο ημιζωής Βελτίωση των κινητικών χαρακτηριστικώv ΟΜΩΣ: δεν πρέπει να επηρεαστεί ο βαθμός αποσιώπησης antisense strand σε κατάλληλες θέσεις sense strand μεγαλύτερη δεκτικότητα Η υδροξυλομάδα του 5΄ άκρου της antisense αλυσίδας πρέπει να φωσφορυλιωθεί
Χημικές τροποποιήσεις PS: πολύ σταθερά και εύκολα στην κατασκευή Σε μεγάλη συγκέντρωση τοξικά OΜe: μεγάλο μέγεθος , αναστολή αν βρίσκεται σε ολόκληρο το siRNA 2΄ fluoro-nucleotide: μικρό μέγεθος, δεν επηρεάζει
Χημικές τροποποιήσεις LNAs: (locked nucleic acid) μεγάλη σταθερότητα έναντι των νουκλεασών και μεγάλη συγγένεια για το mRNA – στόχο αδρανοποίηση της sense αλυσίδας ΟΜΩΣ: σημαντικές δομικές αλλαγές πλήρης τροποποίηση δε μπορεί να γίνει sisiRNA: τρεις αλυσίδες, η antisense με δυο μικρότερες (10-12 νουκλεοτιδίων)
Φορείς έκφρασης Μεγαλύτερη διάρκεια DNA αλληλουχία δημιουργία ενός shRNA (short hairpin RNA) Dicer σε siRNA Πλασμίδια Διαγονιδιακά ζώα ΟΜΩΣ: η ενσωμάτωση είναι τυχαία η ικανότητα αποσιώπησης ποικίλει Υπάρχει κίνδυνος αποσιώπησης σημαντικών γονιδίων Inducible systems Αντιστρεπτά και μη αντιστρεπτά
Μεταφορά στο κύτταρο Με ιούς shRNAs expression cassettes Μικροένεση Ηλεκτροδιάτρηση Soaking Με ιούς shRNAs expression cassettes Ρετροιοί Αδενοιοί Lentivirus Άλλα συστήματα ιών: AAV (adeno-associated virus) Baculovirus Με βακτήρια (ασφάλεια, έλεγχος με αντιβιοτικά)
Μεταφορά στο κύτταρο Χωρίς ιούς συνθετικά siRNAs Μη ειδική μεταφορά α) λιπόσωμα α) σύνδεση με αντίσωμα για πρωτεΐνη ειδική για τα κύτταρα που μας ενδιαφέρουν β)σύνδεση με μόριο χοληστερόλης β)πεπτίδιο
Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων Εφαρμογές Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων Επιμόλυνση με διαφορετικούς συνδυασμούς siRNAs Διερεύνηση ενός πολυπρωτεϊνικού συμπλόκου 100% ταυτότητα διαφορική αποσιώπηση αλληλόμορφων γονιδίων Επιλεκτική αποσιώπηση του πρωτοογκογονιδίου ή του μεταλλαγμένου ογκογονιδίου σε καρκινικά κύτταρα Μελέτη διάφορων ισομορφών πρωτεϊνών και της λειτουργίας τους
Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων Εφαρμογές Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων Πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη μεταγωγή σήματος καθορισμός του ρόλου της κάθε πρωτεΐνης στη οδό μεταγωγής σήματος π.χ μείωση της έκφρασης της υπομονάδας 110β της PI3-K μείωση της ανάπτυξης και της ικανότητας διήθησης των καρκινικών κυττάρων 2) Πρωτεΐνες που συμμετέχουν στον κυτταρικό θάνατο κύριο πρόβλημα σε αρκετές νόσους (νευροεκφυλιστικές διαταραχές, καρκίνος, ..) διερέυνηση γνωστών αποπτωτικών γονιδίων π.χ p53
Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων Εφαρμογές Μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων 3) Πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο σημαντικές λειτουργίες αλλά και στην αντιμετώπιση του καρκίνου 4) Πρωτεΐνες που συμβάλλουν στην κυτταρική ανάπτυξη και κινητικότητα 5) Εισβολή των ιών στα κύτταρα Κατανόηση αλληλεπιδράσεων μεταξύ ιού και κυττάρου και του ρόλου των πρωτεϊνών Μηχανισμός δράσης των ιών π.χ ιός ηπατίτιδας C
Μελλοντικές εφαρμογές Θεραπεία Αντιμετώπιση ασθενειών αποσιώπηση ενός ή περισσότερων γονιδίων μπορεί να επιβραδύνει ή να σταματήσει την πρόοδο της ασθένειας Αποσιώπηση μη φυσιολογικών γονιδίων που σχετίζονται με την ασθένεια ή μεταλλαγμένων γονιδίων 1) Λοιμώδεις νόσοι αναστολή πολλαπλασιασμού ή της εισόδου στο κύτταρο ιών και άλλων παθογόνων 2) Νευροεκφυλιστικές διαταραχές συγκεκριμένες γενετικές μεταλλάξεις
Μελλοντικές εφαρμογές Θεραπεία 3) Καρδιαγγειακές νόσοι μείωση της βλάβης του καρδιακού ιστού 4) Καρκίνος Η αναστολή της μεταγραφής ενός η περισσότερων γονιδίων ταυτόχρονα Επιλεκτική στόχευση Γονίδιο το οποίο εμπλέκεται αποκλειστικά στην ανάπτυξη ή επιβίωση του καρκινικού κυττάρου π.χ her-2/neu – καρκίνος του μαστού σημειακές μεταλλάξεις του ras Γονίδια τα οποία υπερκεράζονται π.χ το γονίδιο της τελομεράσης, γονίδια αυξητικών παραγόντων,… Γονίδια που σχετίζονται με την αγγειογένεση
ευχαριστώ