Μελέτη των λειτουργιών του πεπτικού συστήματος Προσομοίωση πεπτικών διεργασιών Πέψη πρωτεϊνών (μετουσιωμένη καζεΐνη)

Σκοπός προσομοίωση: Καταγραφή των –διαφορετικών- συνθηκών και υλικών που απαιτούνται για τη μελέτη της πέψης αμύλου, πρωτεϊνών και λιπών σε ελάχιστο χρόνο Προσδιορισμός της δραστικότητας πεπτιδασών σε εκχυλίσματα της πεπτικής οδού Σύγκριση της δραστικότητας πεπτιδασών σπονδυλωτών- ασπόνδυλων Δοκιμασία Lowry

Εισαγωγή :Σχέση δομής πεπτικού σωλήνα-τροφής Όλα τα ζώα μετά τους πλατυέλμινθες έχουν πεπτικό σωλήνα με διαφορετικό επίπεδο πολυπλοκότητας και οργάνωσης Η φύση της τροφής καθορίζει και τον τρόπο πρόσληψης (ανατομική κατασκευή, μηχανισμό) Η χημική σύσταση της τροφής καθορίζει τη δομή του πεπτικού σωλήνα Οι μηχανισμοί διατροφής δεν είναι παράλληλοι με τη συστηματική θέση αλλά εξαρτώνται από το είδος και το μέγεθος της τροφής

Ρόλος του πεπτικού σωλήνα Οποιαδήποτε μορφή έχει η τροφή, πρέπει να αποκαλυφθούν τα χρήσιμα υποστρώματα (λίπη, υδατάνθρακες και πρωτεΐνες) ώστε να διασπαστούν σε «τελικά προϊόντα»

Τα τελικά προϊόντα της πέψης υδατάνθρακες πρωτεΐνες λίπη

Διεργασίες στον πεπτικό σωλήνα: πέψη, έκκριση, απορρόφηση, κινητικότητα Τα τελικά προϊόντα της πέψης πρέπει να απορροφηθούν από το εντερικό επιθήλιο και να μεταφερθούν στους ιστούς

Απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών

Απορρόφηση …

η σταθερά μεταφοράς των θρεπτικών συστατικών σε διάφορους οργανισμούς

Ποιότητα τροφής και πέψη

υδατάνθρακες πρωτεΐνες λίπη προσομοίωση: Καταγραφή των –διαφορετικών- συνθηκών και υλικών που απαιτούνται για τη μελέτη της πέψης αμύλου, πρωτεϊνών και λιπών σε ελάχιστο χρόνο υδατάνθρακες πρωτεΐνες λίπη Διαφορετικά τελικά προϊόντα απαιτούν διαφορετικά αντιδραστήρια ανίχνευσής τους

Πέψη αμύλου (starch) από την αμυλάση της σιέλου Πως επηρεάζει το ρΗ τη δραστικότητα; Ποιοι σωλήνες θεωρούνται «μάρτυρες» του πειράματος; Πως επηρεάζει ο βρασμός τη δραστικότητα των ενζύμων;

Πέψη πρωτεϊνών από την πεψίνη Πως επηρεάζει το ρΗ τη δραστικότητα; Ποιοι σωλήνες θεωρούνται «μάρτυρες» του πειράματος; Πως επηρεάζει ο βρασμός τη δραστικότητα των ενζύμων;

Πέψη λιπών από την παγκρεατική λιπάση και δράση των χολικών αλάτων Πως επηρεάζει το ρΗ τη δραστικότητα; Ποιοι σωλήνες θεωρούνται «μάρτυρες» του πειράματος;

Πέψη: ένζυμα του πεπτικού συστήματος

Πειραματική διαδικασία Ετοιμάζουμε τα εκχυλίσματα των ιστών σε 0,1Μ φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος pH 7,0, έτσι ώστε να έχουμε τις παρακάτω τελικές αραιώσεις: (Σ) Εκχύλισμα λεπτού εντέρου, βατράχου1:20 (Α) Εκχύλισμα ηπατοπαγκρέατος, σαλιγκαριού1:10 Μοιράζουμε τα (Σ-Α) σε 2 δοκιμαστικούς σωλήνες, θερμαίνουμε τον έναν από αυτούς στους 95°C για 10 λεπτά και τοποθετούμε τον άλλο σε πάγο. Ετοιμάζουμε δοκιμαστικούς σωλήνες (α1 α2 β1 β2) και ακολουθούμε την παρακάτω διαδικασία:  

Πειραματική διαδικασία Σειρά α (εκχύλισμα Σ) Διάλυμα (ml) α1 α2 Υπόστρωμα: καζεΐνη 4% (w/v) 0.5 Ρυθμιστικό διάλυμα ΡΟ4 1 Εκχύλισμα 95°C - Εκχύλισμα (0°C) Σειρά β (εκχύλισμα Α) Διάλυμα (ml) β1 β2 Υπόστρωμα: καζεΐνη 4% (w/v) 0.5 Ρυθμιστικό διάλυμα ΡΟ4 1 Εκχύλισμα 95°C - Εκχύλισμα (0°C)

Πειραματική διαδικασία Επώαση : στους 37°C Διάρκεια: για 30 λεπτά. Τερματίζουμε την αντίδραση με προσθήκη TCA (0.5ml) και φυγοκεντρούμε για 10 λεπτά στις 3000στροφές / λεπτό. Μεταφέρουμε από το υπερκείμενο 0.1 ml στους αντίστοιχους σωλήνες α1΄-β2΄ (στο τυφλό προσθέτουμε 0.1 ml νερό ), και προσθέτουμε 2 ml αντιδραστηρίου Δ, αναμιγνύουμε και επωάζουμε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν προσθέτουμε 0.2 ml αντιδραστήριο Follin, αναμιγνύουμε και επωάζουμε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια μετράμε την οπτική πυκνότητα των δειγμάτων στα 750 nm. «Η δοκιμασία πρωτεΐνης Lowry είναι μια βιοχημική δοκιμασία για τον προσδιορισμό του συνολικού επιπέδου πρωτεΐνης σε ένα διάλυμα. Η ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης επιδεικνύεται από την αλλαγή χρώματος του διαλύματος σε αναλογία προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης, η οποία μπορεί στη συνέχεια να μετρηθεί χρησιμοποιώντας χρωματομετρικές τεχνικές. Πήρε το όνομά της από τον βιοχημικό Oliver H. Lowry ο οποίος ανέπτυξε το αντιδραστήριο στη δεκαετία του 1940. Δημοσίευση του 1951 που περιγράφει την τεχνική είναι η πιο συχνή αναφορά στην επιστημονική βιβλιογραφία, που παρατίθεται πάνω από 300.000 φορές»

Η μέθοδος Lowry χρησιμοποιείται με συγκεντρώσεις πρωτεΐνης Lowry protein assay Η μέθοδος συνδυάζει τις αντιδράσεις των ιόντων χαλκού με πεπτιδικούς δεσμούς υπό αλκαλικές συνθήκες (δοκιμή διουρίας ) με την οξείδωση των αρωματικών καταλοίπων (κυρίως τρυπτοφάνη και τυροσίνη ). Η μέθοδος Lowry χρησιμοποιείται με συγκεντρώσεις πρωτεΐνης 0,01-1,0 mg / mL Βασίζεται στην αντίδραση του Cu + με το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu (μείγμα φωσφοβολφραμικού και φωσφομολυβδικού οξέος). Η συγκέντρωση μετράται με απορρόφηση στα 750 nm. Η δοκιμασία δικιγχονινικού οξέος (BCA) είναι μεταγενέστερη τροποποίηση της αρχικής διαδικασίας Lowry. {BCA: biochemical assay for determining the total concentration of protein in a solution (0.5 μg/mL to 1.5 mg/mL), similar to Lowry protein assay, Bradford protein assay}

Πειραματική διαδικασία Πρότυπη καμπύλη αλβουμίνης (αρχική συγκέντρωση: 0.2mg/ml) Αριθμός σωλήνα Πρότυπο διάλυμα αλβουμίνης (μl) H2O (μl) OD 1 - 100 2 10 90 0.098 3 20 80 0.149 4 30 70 0.221 5 40 60 0.264 6 50 0.302 7 0.353 8 0.412 9 0.451 0.497 Μάρτυρας υποστώματος (μετουσιωμένη καζεΐνη) : 0.021

Υπολογισμοί Σχεδιασμός της πρότυπης καμπύλης Αφαίρεση της OD του «θορύβου» {OD του σωλήνα 2 και OD καζεΐνης (0.021)} από την OD στα κυρίως δείγματα (1) Υπολογισμός των πεπτιδίων στο δείγμα φωτομέτρησης (0.1ml) Αναγωγή στο συνολικό όγκο της αντίδρασης (2.5ml, στον οποίο είχε προστεθεί 0.5ml εκχυλίσματος) Υπολογισμός των πεπτιδίων που προέκυψαν ανά γραμμάριο ιστού (με βάση τη διαδικασία –αραίωση- εκχύλισης) και ανά λεπτό (διαιρώντας με το συνολικό χρόνο αντίδρασης)