Ανάλυση ενδοκυτταρικών FACS κυτταρομετρία ροής Διαχωρισμός κυττάρων Ανάλυση ανοσοφαινοτύπου Ανάλυση κυτταρικού κύκλου Ανάλυση απόπτωσης Ανάλυση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών

Flow Cytometry Flow Sorting Μελέτη ιδιοτήτων κυττάρων σε εναιωρήματα Διαχωρισμός κυττάρων Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

1948 1956 1970 2000- 1990

Μηχανική ρευστών Οπτική Ηλεκτρονική Κύτταρα σε μορφή εναιωρήματος Νηματική ροή διαμέσου ενός ειδικού θαλάμου Επίδραση φωτονίων Φαινόμενα σκεδασμού και εκπομπής φωτός (φθορισμού) Ποσοτικοποίηση και ψηφιοποίηση Αποθήκευση σε ηλεκτρονική μορφή Μηχανική ρευστών Οπτική Ηλεκτρονική

Μηχανική ρευστών Απαιτείται νηματική ροή των κυττάρων ανά ένα σε μορφή εναιωρήματος Στα περισσότερα όργανα αυτό επιτυγχάνεται με διοχέτευση των κυττάρων διαμέσου ενός περιβλήματος από υγρό που διέρχεται μέσα από ένα στενό ακροφύσιο (50-300 µm)

Ροή κυττάρων φθορισμός προσπίπτουσα δέσμη LASER υγρό περίβλημα Purdue University Cytometry Laboratories

Οπτική Απαιτείται η εστίαση μιας δέσμης φωτός στο σημείο διέλευσης των κυττάρων Υπάρχουν δυο ειδών πηγές: - Lasers (ιόντων Αργού, ιόντων Κρυπτού, HeNe, HeCd) - Arc-lamps (Hg, Hg-Xe)

Πηγές φωτός Lasers Παράγουν φως συγκεκριμένου μήκους κύματος (δέσμη laser) ή σπανιότερα ένα φάσμα μηκών κύματος παράγουν milliwatts έως watts φωτός οικονομικές αερόψυκτες ή ακριβές υδρόψυκτες μονάδες

Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

Lasers Helium-Neon Argon He-Cd

Πηγές φωτός Arc-lamps Παράγουν ένα φάσμα μηκών κύματος το οποίο απαιτεί φιλτράρισμα για την επιλογή των επιθυμητών μηκών κύματος παράγουν milliwatts φωτός οικονομικές αερόψυκτες μονάδες

Purdue University Cytometry Laboratories Mercury Arc Lamps φακός Arc φακός Purdue University Cytometry Laboratories

Οπτικά κανάλια Ένα οπτικό κανάλι είναι η οδός που ακολουθεί το φως από το σημείο που παράγεται μέχρι έναν ανιχνευτή Διάφορα οπτικά στοιχεία παρέχουν δυνατότητες διαχωρισμού των καναλιών και επιλογής των μηκών κύματος

Kανάλι πρόσθιας σκέδασης (μηδενικής γωνίας) (FSC) Ανίχνευση της σκέδασης του φωτός στην διεύθυνση της ακτίνας laser Η ένταση του FSC είναι ανάλογη του μεγέθους, του σχήματος και της οπτικής ομοιογένειας των κυττάρων

Ανίχνευση πρόσθιας σκέδασης (υπό γωνία 0ο, FSC) Ανιχνευτής 0ο Laser Purdue University Cytometry Laboratories

Kανάλι πλάγιας σκέδασης (ορθής γωνίας) (SSC) Ανίχνευση της σκέδασης του φωτός υπό γωνία 90ο με την προσπίπτουσα δέσμη laser Η ένταση του SSC είναι ανάλογη του μεγέθους, του σχήματος και της οπτικής ομοιογένειας των κυττάρων

Ανίχνευση πλάγιας σκέδασης (υπό γωνία 90ο, SSC) Ανιχνευτής 0ο Ανιχνευτής 90ο Laser Purdue University Cytometry Laboratories

Σκέδαση φωτός Το FCS είναι αντιπροσωπευτικό των επιφανειακών ιδιοτήτων των κυττάρων (π.χ. σχήμα, μέγεθος) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την διάκριση των ζωντανών από τα νεκρά κύτταρα Το SSC είναι αντιπροσωπευτικό της εσωτερικής πολυπλοκότητας των κυττάρων (π.χ. κοκκίωση) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την διάκριση των κυττάρων που φέρουν κοκκία

Kανάλια φθορισμού Ο φθορισμός που εκπέμπεται από κάθε φθοριόχρωμα, ανιχνεύεται μέσω ενός ειδικού καναλιού φθορισμού Η ειδικότητα της ανίχνευσης ελέγχεται μέσω της επιλογής μηκών κύματος, που επιτυγχάνεται με την χρήση οπτικών φίλτρων και κατόπτρων

Ανιχνευτές φθορισμού Πηγή Laser Ανιχνευτής FSC Ανιχνευτής φθορισμού Φθορισμός Ανιχνευτής φθορισμού Purdue University Cytometry Laboratories

Ιδιότητες φίλτρων Τα οπτικά φίλτρα κατασκευάζονται από υλικά που απορροφούν συγκεκριμένα μήκη κύματος (και παράλληλα εκπέμπουν άλλα) Οι μεταβάσεις μεταξύ απορρόφησης και εκπομπής δεν είναι τέλειες. Κατά τον σχεδιασμό του φίλτρου καθορίζεται η ακρίβεια

Ιδιότητες φίλτρων Φίλτρα μακράς διόδου: εκπέμπουν μήκη κύματος από μια τιμή και πάνω Φίλτρα βραχείας διόδου: εκπέμπουν μήκη κύματος από μια τιμή και κάτω Φίλτρα διόδου δέσμης: εκπέμπουν ένα περιορισμένο φάσμα μηκών κύματος γύρω από μια προκαθορισμένη τιμή

Φίλτρο μακράς διόδου 520 nm Πηγή φωτός Εκπεμπόμενο φως >520 nm Φιλτρο βραχείας διόδου 575 nm Πηγή φωτός Εκπεμπόμενο φως <575 nm Φίλτρο δέσμης 630 nm Πηγή λευκού φωτός Εκπεμπόμενο φως 620 -640 nm Purdue University Cytometry Laboratories

Ιδιότητες φίλτρων Όταν ένα φίλτρο τοποθετείται υπό γωνία 45ο σε σχέση με τη φωτεινή πηγή, τότε το φως ανακλάται (90ο) Όταν ένα φίλτρο χρησιμοποιείται με τον παραπάνω τρόπο ονομάζεται διχροϊκό φίλτρο ή διχροϊκό κάτοπτρο

Διχροϊκό φίλτρο/κάτοπτρο Φίλτρο υπό γωνία 45o Εκπεμπόμενο φως Πηγή φωτός Ανακλώμενο φως

Διάταξη φίλτρων Η ταυτόχρονη μέτρηση περισσοτέρων του ενός σκεδασμού ή φθορισμού από κάθε κύτταρο, απαιτεί την χρήση πολλαπλών καναλιών Ο σχεδιασμός διατάξεων πολλαπλών καναλιών πρέπει να λαμβάνει υπόψη: Φασματοσκοπικές ιδιότητες των φθοριοχρωμάτων που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν Κατάλληλη διάταξη φίλτρων και κατόπτρων

PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid 457 350 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid Purdue University Cytometry Laboratories

Ανιχνευτές Διακρίνονται δυο είδη ανιχνευτών: Φωτοδίοδοι Χρησιμοποιούνται στην περίπτωση ισχυρών σημάτων όταν τα φαινόμενα κορεσμού αποτελούν εν δυνάμει πρόβλημα Φωτοπολλαπλασιαστές (PMT) Περισσότερο ευαίσθητοι από τις φωτοδιόδους, αλλά μπορεί να καταστραφούν μετά από έκθεση σε ισχυρά σήματα

Purdue University Cytometry Laboratories Παράδειγμα διάταξης καναλιών για κυτταρομετρία ροής βασιζόμενη σε Laser PMT 4 Διχροϊκά φίλτρα PMT Θάλαμος ροής 3 PMT 2 Φίλτρα δέσμης PMT 1 Laser Purdue University Cytometry Laboratories

Coulter Optical System - Elite PMTs Θέση διχροϊκού φίλτρου

Ηλεκτρονική Επεξεργασία των σημάτων που προέρχονται από τους ανιχνευτές (προενίσχυση, ενίσχυση) Συλλογή δεδομένων κάθε μέτρηση που προέρχεται από κάθε ανιχνευτή αποτελεί μια «παράμετρο» τα δεδομένα συλλέγονται με τη μορφή μιας σειράς τιμών για κάθε «παράμετρο» (μεταβλητή) για κάθε «γεγονός» που καταγράφεται από τον ανιχνευτή (κύτταρο)

Συλλογή και καταγραφή δεδομένων Γεγονός Παράμετρος 1 (FSC) Παράμετρος 2 (SSC) Παράμετρος 3 (FL1-FITC) Παράμετρος 4 (FL2-PE) 1 50 100 80 90 2 55 110 150 95 3 60 30

Παρουσίαση και ανάλυση δεδομένων

Παρουσίαση και ανάλυση δεδομένων Ιστόγραμμα πλάγιας σκέδασης Neutrophils Scale 1000 200 100 Σκέδαση 0ο Ιστόγραμμα πρόσθιας σκέδασης 50 200 400 600 800 1000 40 Monocytes 30 20 15 Lymphocytes 8 200 400 600 800 1000 Σκέδαση 90ο Purdue University Cytometry Laboratories

Παρουσίαση και ανάλυση δεδομένων

Παρουσίαση και ανάλυση δεδομένων (Gating)

Παρουσίαση και ανάλυση δεδομένων

Παρουσίαση και ανάλυση δεδομένων Τ = CD3+, αντι-CD3-FITC TH = CD4+, αντι-CD4-PE TC = CD8+, αντι-CD8-PE NK = CD56+, αντι-CD56-PE B = CD19+, αντι-CD19-PE 0% Isotype control 42% 31% 0% CD3/CD4 26% 43% 3% CD3/CD8 CD3/CD56 11% 66% 4% CD3/CD19 0% 16% 71%

Διαχωρισμός κυττάρων (Flow Sorting) Σχηματισμός σταγόνων Συγχρονισμός, φόρτιση και διαχωρισμός Καθαρότητα και αποδοτικότητα

Fluorescence Activated Ανιχνευτής πρόσθιας σκέδασης Cell Sorting Ανιχνευτής πρόσθιας σκέδασης 488 nm laser Ανιχνευτής φθορισμού - + Φορτισμένες πλάκες Διαχωρισμός κυττάρων Purdue University Cytometry Laboratories

Σχηματισμός σταγόνων Καθώς το υγρό εξέρχεται στον αέρα, σχηματίζει σταγόνες. Το μέγεθος και η απόσταση μεταξύ των σταγόνων ελέγχονται με μεγάλη ακρίβεια, διαμέσου ταλάντωσης με διαφορετικές συχνότητες του ακροφυσίου εξαγωγής

Καθαρότητα και αποδοτικότητα Καθώς σχηματίζονται οι σταγόνες, είναι δυνατό να περιέχουν επιθυμητά αλλά και ανεπιθύμητα κύτταρα. Ο διαχωρισμός όλων των σταγόνων που περιέχουν επιθυμητά κύτταρα (ανεξάρτητα από το αν περιέχουν και ανεπιθύμητα κύτταρα) οδηγεί σε ελάττωση της καθαρότητας Η καθαρότητα είναι δυνατό να αυξηθεί με την απόρριψη των επιθυμητών κυττάρων που βρίσκονται κοντά σε ανεπιθύμητα. Με αυτόν τον τρόπο αυξάνεται η καθαρότητα, αλλά ελαττώνεται η αποδοτικότητα

Φόρτιση σταγόνων Οι σταγόνες στην περίπτωση που περιέχουν το επιθυμητό είδος κυττάρων φορτίζονται Οι σταγόνες που περιέχουν ανεπιθύμητα κύτταρα παραμένουν αφόρτιστες Δυνατότητα ταυτόχρονου διαχωρισμού τριών ειδών κυττάρων + + Α + Β - - Γ -

- + Διαχωρισμός σταγόνων Στη συνέχεια οι σταγόνες διέρχονται κατά μήκος ενός ηλεκτρικού πεδίου ελεγχόμενης πολικότητας Οι φορτισμένες σταγόνες και κατ’επέκταση τα κύτταρα που περιέχουν διαχωρίζονται κατά βούληση + + - + - - + + - + - + -

Εφαρμογές Προσδιορισμός ανοσοφαινοτύπου Ανάλυση απόπτωσης Μελέτη κυτταρικού κύκλου Μελέτη ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών (κυτταροκίνες, υποδοχείς, κ.α.) Μοριακή κυτταρογενετική Ανάλυση κυτταρικής λειτουργίας (βιοσιμώτητα, ενδοκυτταρικό pH, οργανίδια, οξειδωτικός μεταβολισμός, δυναμικό κυτταρικής μεμβράνης, ενδοκυτταρικά Ca++, έλεγχος έκφρασης γονιδίων)