Ρύθμιση της κυτταρικής φυσιολογίας από ιόντα ασβεστίου Κυτταρική διαίρεση Μυϊκή σύσπαση Έκκριση Μεταβολισμός Αντίληψη, μνήμη Έκφραση γονιδίων Παροδικές αυξήσεις

Φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα (calcium channel blockers) Amlodipine (Norvasc) Diltiazem (Cardizem, Tiazac) Felodipine Isradipine Nicardipine (Cardene SR) Nifedipine (Procardia) Nisoldipine (Sular) Verapamil (Calan, Verelan, Covera-HS)

: R. D. Fields, Visualizing Calcium Signaling in Astroctyes. Sci : R. D. Fields, Visualizing Calcium Signaling in Astroctyes. Sci. Signal. 3, tr5 (2010).

Β-λεμφοκύτταρα

Apoptosis and Autophagy: Decoding Calcium Signals that Mediate Life or Death .Michael W. Harr , and Clark W. Distelhorst Cold Spring Harb Perspect Biol 2010;2:a005579

Συσσώρευση ασβεστίου Μείωση ΑΤΡ ΑΤΡάση φωσφολιπάση πρωτεάση ενδονουκλεάση Βλάβες χρωματίνης Μείωση φωσφολιπιδίων Αποδιάταξη μεμβρανικών πρωτεινών Μείωση ΑΤΡ

Πως είναι δυνατόν ένα απλό σήμα όπως είναι το ασβέστιο, να ρυθμίζει τόσες πολλές και τόσο διαφορετικές κυτταρικές διεργασίες;;;;;;;

Lifetime, diffusion constant and diffusion length of cellular messengers Lifetime (s) Diffusion constant, μm/s Diffusion length, μm Free calcium 3x10-5 233 0.08 Buffered calcium 1 13 3.6 IP3 283 17 cGMP 1-~60 500 20-170 cAMP 1-60 780 30-220 Nitric oxide 4 2300 90 Membrane potential 0.02- ~ 0.05 106-108 200-2000

συντονισμός διέγερση Δημιουργία σημάτων κινητοποίησης Ca2+ Μηχανισμοί έναρξης 100nM Μηχανισμοί λήξης 500-1000nM απόκριση

Ομάδες πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην ομοιόσταση ασβεστίου Ca2+ PMCA Na+/Ca2+ ανταλάκτης Ca2+ πρόσδεση SERCA [Ca2+] [Ca2+] Ca2+ Ca2+ αισθητήρας ER IP3 Ca2+ πρόσδεση IP3R RyR Ca2+ δίαυλοι Ca2+ PMCA – Plasma membrane Ca2+-ATPase SERCA – Smooth ER Ca2+-ATPase διέγερση

Δημιουργία σημάτων κινητοποίησης Ca2+ διέγερση Εξωτερικά σήματα : προσδέτες μεμβρανικών υποδοχέων στρεσογόνοι παράγοντες Εσωτερικά σήματα : προϊόντα μεταβολισμού Δημιουργία σημάτων κινητοποίησης Ca2+ Από εξωτερικά σήματα: Μεταγωγή σήματος : ενεργοποίηση G - πρωτεϊνών – ενεργοποίηση φωσφολιπάσης C - παραγωγή InsP3 Από εσωτερικά σήματα: Δημιουργία κατάλληλων τελικών μεταβολικών προϊόντων

Μηχανισμοί έναρξης Μηχανισμοί λήξης Ενεργοποίηση διαύλων : στην μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου στην πλασματική μεμβράνη Συμμετοχή των μιτοχονδρίων Μηχανισμοί λήξης Ενεργοποίηση αντλιών στην μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου και στην πλασματική μεμβράνη Απομάκρυνση περίσσειας ιόντων από τα μιτοχόνδρια Κινητοποίηση πρωτεϊνών που προσδένουν ασβέστιο –κυρίως εντός του ενοπλασματικού δικτύου

Συγκεντρώσεις ασβεστίου σε σημαντικές θέσεις Συγκεντρώσεις ασβεστίου σε σημαντικές θέσεις 1-10mM Πυρήνας 10-50nM Ca2+ Μιτοχόνδια 1mM Ca2+ Εκκριτικά κυστίδια Ca2+ ΕΔ 1mM Κυτταρόπλασμα 100-200nM

Μεταγωγή σήματος : ενεργοποίηση G - πρωτεϊνών – ενεργοποίηση φωσφολιπάσης Cγ - παραγωγή InsP3

Από εσωτερικά σήματα: Δημιουργία κατάλληλων τελικών μεταβολικών προϊόντων

Μηχανισμοί έναρξης Απελευθέρωση ασβεστίου Η απελευθέρωση του ασβεστίου από τις ενδοκυτταρικές αποθήκες γίνεται μέσω υποδοχέων ρυανοδίνης και τριφοσφωρικής ινοσιτόλης που είναι ταυτόχρονα και δίαυλοι ασβεστίου… και επακόλουθη είσοδο ιόντων από διαύλους της πλασματικής μεμβράνης

Μηχανισμοί έναρξης Δίαυλοι πλασματικής μεμβράνης Δίαυλοι ΕΔ

Διευθέτηση του υποδοχέα ΙΡ3

Υποδοχέας ρυανοδίνης

Απόκριση των υποδοχέων ρυανοδίνης στο ασβέστιο

Μηχανισμοί λήξης : αντλίες, πρωτεΐνες δέσμευσης και μεταφορά σε μιτοχόνδρια

Πρωτεϊνες δέσμευσης του Ca2+ Μηχανισμοί λήξης Πρωτεϊνες δέσμευσης του Ca2+ Τα ιόντα που εισέρχονται στο Ε.Δ. δεν παραμένουν ελεύθερα αλλά δεσμεύονται σε συγκεκριμένες πρωτεϊνες Οι κυριότερες πρωτεϊνες είναι οι Καλσεκουεστρίνες (CQS) και Καλρετικουλίνες (CR) Δεν επιτρέπουν τη συσσώρευση αδιάλυτου φωσφορικού ασβεστίου και διατηρούν σταθερό το pH κατά τις αλλαγές της [Ca2+]

Η δομή της καλρετικουλίνης Μηχανισμοί λήξης Πρωτεϊνες δέσμευσης του Ca2+ Η δομή της καλρετικουλίνης

Διευθέτηση της καλσεκεστρίνης στο ΕΔ

Τελικά αποτελέσματα

Αποτέλεσμα θέσης

Φθορισμομετρία Χρησιμοποιείται η χρωστική Fura-2 Εισάγεται στο κύτταρο με τη μορφή του ακετυλομεθυλεστέρα Fura-2AM Η Fura-2 δεσμεύει τα ελεύθερα ιόντα ασβεστίου. Είναι ένας δείκτης φθορισμού με μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση για το ασβέστιο. Επιτρέπει την ποσοτική μέτρηση του [Ca2+]i Ο δείκτης παρουσιάζει ένα μέγιστο εκπομπής στα 510nm και δύο μέγιστα διέγερσης στα 340nm και 380nm. Για τα πειράματά μας έγινε διέγερση στα 345nm Φάσματα εκπομπής του ελεύθερου οξέος Fura-2 και του αντίστοιχου μεθυλεστέρα

Οι φθορίζοντες δείκτες ασβεστίου πρέπει να πληρούν τα κριτήρια: Εκλεκτικότητα : αποφυγή του μαγνησίου Ευαισθησία : 10nM -100μM Ταχύτητα απόκρισης : 10msec Ενσωμάτωση : συσσώρευση στο κυτταρόπλασμα χωρίς να προκαλούν δομικές ή λειτουργικές αλλαγές, να είναι σταθεροί και μη τοξικοί Επίδραση στην ισορροπία του ασβεστίου : καμία Διάχυση : δεν πρέπει να επηρεάζει το σήμα Κατανομή : ο δείκτης πρέπει να επιτρέπει την ανίχνευση διαφορετικών συγκεντρώσεων σε διαφορετικές περιοχές ενός κυττάρου Διαθεσιμότητα : χαμηλό κόστος, εύκολη χρήση

Διαγράμματα μετρήσεων Ca2+ 2002 p54 2002 p32 HFFF2 p55 HFFF2 p19 Werner Centenarians

“calcium imaging”

Πως είναι δυνατόν ένα απλό σήμα όπως είναι το ασβέστιο, να ρυθμίζει τόσες πολλές και τόσο διαφορετικές κυτταρικές διεργασίες;;;;;;; Διαμόρφωση πλάτους: τα κύτταρα απελευθερώνουν άλλοτε μικρή και άλλοτε μεγάλη ποσότητα ασβεστίου. Σε κάθε περίπτωση ενεργοποιείται ένα διαφορετικό μονοπάτι φωσφορυλιώσεων και μεταγραφικών παραγόντων. Διαμόρφωση συχνότητας: η συχνότητα των ταλαντώσεων αλλάζει ανάλογα με τη συγκέντρωση του ερεθίσματος (μεταβολή του ρυθμού έκκρισης, του μεταβολισμού του γλυκογόνου, της νευρονικής διαφοροποίησης) Διαμερισματοποίηση: σε συνδυασμό με τη διαμερισματοποίηση και το βαθμό κορεσμού των πρωτεϊνών που προσδένουν ασβέστιο. Αύξηση του ασβεστίου στο κυτταροδιάλυμα (ενεργοποίηση SRE), αύξηση του ασβεστίου στον πυρήνα (ενεργοποίηση CaRE)

ανάλογα με το είδος του σήματος ασβεστίου…… Στοιχειώδη γεγονότα έκκριση κυστιδίων, διεγερσιμότητα μεμβρανών, αποκατάσταση (ηρεμία) λείου μυός, μίτωση, πλαστικότητα συνάψεων, μεταβολισμός μιτοχονδρίων Ολικό ενδοκυττάριο κύμα γονιμοποίηση, σύσπαση λείου και σκελετικού μυός, σύσπαση καρδιακού μυός, μεταβολισμός ήπατος, μεταγραφή, πολλαπλασιασμός κυττάρων Ολικό διακυτταρικό κύμα επούλωση τραύματος, κίνηση βλεφαρίδων, έκκριση ινσουλίνης, επαγωγή σύνθεσης οξειδίου του αζώτου στο ενδοθήλιο

λεμφοκύτταρα

Τα συστατικά της ομοιόστασης ασβεστίου στα Τ λεμφοκύτταρα

Annu Rev Immunol. 2010 28: 491–533 Molecular Basis of Calcium Signaling in Lymphocytes: STIM and ORAI Patrick G. Hogan Richard S. Lewis Anjana Rao Feske et al. Ion channels in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 2012; 12:532-47

long-lasting synapse transient kinapse (kinetic synapse) Immunological Reviews 231/2009 Kummerow et al. The immunological synapse and calcium signals

Ασβέστιο, ένα σήμα για όλα;;;;

H. Llewelyn Roderick and Simon J. Cook (Nature reviews Cancer «Every cell expresses a unique complement of components from a Ca2+ signalling toolkit that enables it to generate intracellular Ca2+ signals of a particular amplitude, time course and intracellular location. This Ca2+ signalling fingerprint encodes information that allows Ca2+ to control diverse cellular processes in a specific manner» Ca2+ signalling checkpoints in cancer: remodelling Ca2+ for cancer cell proliferation and survival H. Llewelyn Roderick and Simon J. Cook (Nature reviews Cancer vol. 8 |2008 | 361) The Ca2+ signalsome.

Immunological Reviews 231/2009