Μετασχηματισμός των Φυτών

Οι πιο κοινές μέθοδοι σταθερού μετασχηματισμού των φυτών Μετασχηματισμός με βομβαρδισμό σωματιδίων Απευθείας μεταφορά γονιδίων σε πρωτοπλάστες Μετασχηματισμός με τη χρήση του Agrobacterium tumefaciens

Το Ti πλασμίδιο (tumor-inducing plasmid) του βακτηρίου Agrobacterium tumefaciens αποτελεί το μέσο εισαγωγής «ξένων» γονιδίων στα φυτά Κυκλικό χρωμόσωμα LB RB Ti plasmid ~ 200 kb T-DNA vir γονίδια ori A. tumefaciens

Η δομή του Τ-DNA *Τα συγκεκριμένα γονίδια στη φύση φέρουν RB Shi Roi LB Shi Nos Τα LB και RB – αποτελούν cis δραστικά DNA στοιχεία Nos - συνθάση της νοπαλίνης – Βιοσυνθετικό γονίδιο οπινών Shi – γονίδια που επάγουν την ανάπτυξη όγκων μορφολογίας βλαστού – δύο γονίδια για την συνθάση της αυξίνης* Roi - γονίδια που επάγουν την ανάπτυξη όγκων μορφολογίας ρίζας – γονίδιο για τη σύνθεση κυτοκινινών* *Τα συγκεκριμένα γονίδια στη φύση φέρουν ευκαρυωτικούς προαγωγείς και δεν εκφράζονται στο Α. tumefaciens

Δομή των Vir γονιδίων Η λειτουργία των Vir γονιδίων virA μονοκιστρονικό Κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία προσομοιάζει με άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες, δέκτες χημικών σημάτων. virG Θετικά ρυθμιζόμενη πρωτείνη, η οποία μεταδίδει περιβαλλοντολογικές πληροφορίες (παρουσία επαγωγικών παραγόντων του φυτού) σε διαφορετικά Vir loci, απαιτεί την έκφραση του virA και επηρεάζει ισχυρά τα virB,C,D,E virE πολυκιστρονικό Κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη που προσδένεται σε μονόκλωνο DNA και φαίνεται να «καλύπτει» το Τ-DNA κατά τη μεταφορά του στο φυτικό κύτταρο virC και virD Κωδικοποιούν για εξειδικευμένες ενδονουκλεάσες, οι οποίες αναγνωρίζουν και κόβουν 24bp των συνοριακών του T-DNA, παράγουν ένα Τ-κλώνο, ο οποίος αποτελεί το ενδιάμεσο μόριο που μεταφέρεται στο φυτικό κύτταρο virB Φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην απευθείας μεταφορά του T-DNA στην επιφάνεια του βακτηρίου

Πως είναι να μετατραπεί το Τi πλασμίδιο σε ένα χρήσιμο εργαλείο μετασχηματισμού των φυτών; Απαλοιφή των γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της αυξίνης και της κυτοκινίνης Απομόνωση των vir γονιδίων και του αριστερού και δεξιού συνοριακού (LB, RB) Μείωση του μεγέθους του Ti πλασμιδίου (είναι τεράστιο ~200Kb)

Το A. tumefaciens ως εργαλείο της γενετικής μηχανικής Τα vir γονίδια και το Τ-DNA μπορούν να βρίσκονται σε ξεχωριστά πλασμίδια Μόνο το δεξιό και αριστερό συνοριακό απαιτούνται για τη μεταφορά του T-DNA. Περιοχή κλωνοποίησης Φυτικών γονιδίων Binary vector LB Γονίδιο επιλογής NPTII (Για φυτά) Γονίδιο επιλογής (τζενταμυκίνη) RB T-DNA vir γονίδια Γονίδιο επιλογής (Για βακτήρια καναμυκίνη) ori (E.coli) ori (Agrobacterium) ori (Agrobacterium) Το γονιδίωμα του στελέχους του Α. tumefaciens φέρει γονίδιο που του προσδίδει ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικό (ριφαμπικίνη)

Building the Transgenes ON/OFF Switch Makes Protein stop sign CODING SEQUENCE INTRON poly A signal PROMOTER Plant Selectable Marker Gene Plasmid DNA Construct Plant Transgene bacterial genes antibiotic marker replication origin

GUS

Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana Arabidopsis Genome Sequencing Initiative δικοτυλήδονο, σταυρανθές μικρό μέγεθος μικρός βιολογικός κύκλος (5 εβδομάδες) μεγάλη παραγωγή σπόρων μικρό γονιδίωμα (~ 125Μb) εύκολο πρωτόκολλο γενετικής μεταμόρφωσης  Arabidopsis Genome Sequencing Initiative

Διακοπή λήθαργου σπερμάτων Arabidopsis thaliana (48 h, 4 ºC). Βήματα του μετασχηματισμού φυτών Arabidopsis thaliana με τη μέθοδο εμβάπτισης ανθέων (Floral dip) Προετοιμασία των φυτών Διακοπή λήθαργου σπερμάτων Arabidopsis thaliana (48 h, 4 ºC). Ανάπτυξη φυταρίων για 4 εβδομάδες σε κατάλληλο υπόστρωμα (22 ºC, υγρασία 40%, φωτοπερίοδος 8h φως/ 16h σκοτάδι). Μεταφορά των φυταρίων σε κλίβανο επώασης (22 ºC, υγρασία 40%, φωτοπερίοδος 16h φως/ 8h σκοτάδι).

Βήματα του μετασχηματισμού φυτών Arabidopsis thaliana με τη μέθοδο εμβάπτισης ανθέων (Floral dip) Προετοιμασία Δυαδικού φορέα και μετασχηματισμός κυττάρων A. tumefaciens Υποκλωνοποίηση του υπό μελέτη γονιδίου ή προαγωγέα σε κατάλληλη περιοχή του πλασμιδίου που φέρει το Τ-DNA. Μετασχηματισμός κυττάρων του A. tumefaciens με ηλεκτροπόρωση. «Τριπλή επιλογή» των μετασχηματισμένων κυττάρων σε στερεές καλλιέργειες. Μεταφορά μονής αποικίας σε υγρή καλλιέργεια με αντιβιοτικά για 36h στους 28 ºC. Μεταφορά 1/100 όγκου της υγρής καλλιέργειας σε LB χωρίς προσθήκη αντιβιοτικών για 48h στους 28 ºC. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας και επαναδιάλυση των κυττάρων σε ΙΜ.

Βήματα του μετασχηματισμού φυτών Arabidopsis thaliana με τη μέθοδο εμβάπτισης ανθέων (Floral dip) To διάλυμα του ΙΜ (1lt) 2.2gr MS θρεπτικό διάλυμα αλάτων 1Χ Β5 βιταμίνες 50gr σακχαρόζη, 0,5 MES Ρύθμιση pΗ 5,7 (με ΚΟΗ) και αποστείρωση 0,01mg βενζάμινο πουρίνη ΒΑΡ (έχει δράση κυτοκινίνης) 200μl Silwet L-77

Βήματα του μετασχηματισμού φυτών Arabidopsis thaliana με τη μέθοδο εμβάπτισης ανθέων (Floral dip) Εμβάπτιση των φυτών στη καλλιέργεια του Agrobacterium και τοποθέτηση σε κάδο κενού για 5-10 min. Τα φυτά αφού στεγνώσουν πολύ καλά σε διηθητικό χαρτί καλύπτονται με πλαστική μεμβράνη για 24 ώρες χωρίς να ποτιστούν.

Ποιος είναι ο κυτταρικός στόχος του μετασχηματσμού; Τα μετασηματισμένα φυτά φέρουν το T-DNA σε ημίζυγη κατάσταση Τα φυτά μετασχηματίζονται από ανεξέρτητα γεγονότα Κατά κανόνα τα μετασχηματισμένα φυτά φέρουν το T-DNA σε όλα να φυτικά μέρη Ο μετασχηματισμός φαίνεται να πραγματοποιήται στα αναπτυσσόμενα άνθη μετά τη δημιουργία των ξεχωριστών γαμετών στα μέγα και μικροσπόρια και πριν την ανάπτυξη του εμβρύου Στίγμα του υπέρου στήμονας Στίγμα του υπέρου Πέταλο στήμονας Πέταλο Σέπαλο 1mm

Πλεονεκτήματα της μεθόδου Μειώνει την απαιτούμενη εργασία χωρίς να απαιτεί προσωπικό υψηλής εξειδίκευσης Υψηλά ποσοστά μετασχηματισμένων φυτών Άμεση συλλογή και επιλογή φυτών που μετασχηματίζονται H εισαγωγή του «ξένου» DNA δεν προκαλεί θάνατο του οργανισμού καθώς αυτός βρίσκεται σε ημίζυγη κατάσταση.

Επιλογή μετασχηματισμένων φυτών Βήματα του μετασχηματισμού φυτών Arabidopsis thaliana με τη μέθοδο εμβάπτισης ανθέων (Floral dip) Επιλογή μετασχηματισμένων φυτών Τα φυτά αναπτύσσονται σε τρυβλία με θρεπτικό μέσο επιλογής (SPM) παρουσία αντιβιοτικού και παράγοντα που δεν επιτρέπει την ανάπτυξη του Agrobacterium (σεφοταξίμη) Επώαση των τρυβλίων για δύο εβδομάδες Μεταφορά των μετασχηματισμένων φυτών στο έδαφος