Αρχες Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Εργαστήριο Αρχες Βιοτεχνολογίας Τροφίμων

Σκοπός του εργαστηρίου Η κάθε ομάδα εχει τη δική της υγρή καλλιέργεια μιας ζύμης, μετά από 3 μέρες επώαση και μετράει : γλυκόζη, πρωτεΐνη, Άζωτο

Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος Γλυκόζη 40g/l Yeast extract 2g/l Peptone 2g/l (NH4)2SO4 4g/l KH2PO4 Na2HPO4

Υδρόφοβο βαμβάκι καλυμμένο με αλουμινόχαρτο Σε κωνική φιάλη των 250ml βάζουμε 5Oml από το υγρό θρεπτικό και αποστειρώνουμε Υγρή αποστείρωση 121οC 20min Σε αερόβιες καλλιέργειες ο όγκος του θρεπτικού δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1/3 του όγκου της φιάλης Υδρόφοβο βαμβάκι καλυμμένο με αλουμινόχαρτο

Υγρή αποστείρωση (αυτόκαυστο)

Επώαση στους 30οC με ανάδευση170rpm

Παραλαβή δείγματος 1.5 ml υγρό καλλιέργειας μεταφερεται σε eppendrof και φυγοκεντρείται

Το δείγμα φυγοκεντρείται στις 9000rpm, 10min, 5oC Α Α Β Β Μετά τη φυγοκέντρηση διαχωρίζουμε τις δύο φάσεις Α) το υπερκείμενο δε περιέχει κύτταρα ή κομμάτια τους και θα χρησιμοποιηθεί για μετρήσεις γλυκόζης, πρωτεϊνης κλπ Β) το ίζημα περιέχει τα κύτταρα τις καλλιέργειας (ζωντανά, νεκρά, ολόκληρα ή σπασμένα)

Προσδιορισμός συγκέντρωσης γλυκόζης με τη Μέθοδο προσδιορισμού αναγωγικών σακχάρων δινιτροσαλυκιλικού οξέος (DNS)   Υδατάνθρακες οι οποίοι λέγονται και αναγωγικά σάκχαρα (ή ανάγοντα σάκχαρα). Τέτοια είναι όσα στην δομή τους περιέχουν αλδεϋδομάδα ή α-υδρόξυ-κετοομάδα. Η μέθοδος στηρίζεται στην αναγωγή του 3,5 δι-νιτροσαλικυλικού οξέος προς 3-αμινο-5-νιτροσαλικυλικό οξύ, παρουσία NaOH και την ταυτόχρονη οξείδωση της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ (Miller, 1959).

0.5ml δείγμα + 0.5ml DNS (ανάδευση) 100oC, 5min + 5 ml dH2O (ανάδευση) Mέτρηση απορρόφησης στα 540nm

Πρότυπη καμπύλη γλυκόζης Glc (g/l) A540 0,2 0,132 0,4 0,268 1 0,661 Α540 Glc (g/L)

Μέθοδος προσδιορισμού αζώτου αμινοξέων FAN (Free Amino Nitrogen)

FAN (Free Amino Nitrogen) Διαδικασία: 1 ml Δείγμα + 0,5 ml διάλυμα νινυδρίνης 100oC 16min κρυώνουμε μεχρι θερμοκρασία δωματίου 2.5ml διάλυμα αραίωσης (DR) Α570

Υπολογισμός συγκέντρωσης Ν αμινομάδων Γλυκίνη Το δείγμα σας είναι αραιωμένο τόσες φορές όσες και ο αριθμός της ομάδας σας FAN =A570 x D x2 / As570 FAN (mg/L) D= Συντελεστής αραίωσης 2 = συγκέντρωση πρότυπου Διαλ. Γλυκίνης (mg/l) Αs570 = Απορρόφηση πρότυπου διαλ. Γλυκίνης

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ BRADFORD

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ BRADFORD 0.8ml δείγματος + 0.2ml Διαλύματος Coomassie Brilliant Blue G-250 Ανάδευση (vortex) 5 min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) Μέτρηση απορρόφησης στα 595nm A595 = 0.0505 * μg BSA

Κατασκευή πρότυπης καμπύλης Πρωτεϊνη μg BSA A595 1 0.055 2 0.126 4 0.252 5 0.296 10 0.553 15 0.745 20 0.972 Αραιώστε το δείγμα σας 1/3 (δηλ. 1ml δειγμα και 2 ml H2O) και μετρήστε σε αυτό την πρωτεϊνη (< 20μg) Υπολογίστε την συγέντρωση του δειγματό σας (πριν την αραίωση) σε mg/l