Αλληλεπιδράσεις γονιδίων και διατροφικών συστατικών Γιώργος Δεδούσης Καθηγητής Βιολογίας

ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΕΡΕΥΝΑΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΑΣΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ Μοντέλα ζώων Πλεονεκτήματα Μπορούν να πραγματοποιηθούν με πολύ ελεγχόμενο τρόπο. Η διατροφική πρόσληψη μπορεί εύκολα να καταγραφεί και να τροποποιηθεί ενώ μπορούν να ελεγχθούν και παράγοντες όπως η θερμοκρασία, η υγρασία και η παρουσία παθήσεων. Μπορούν να αποκτηθούν ιστοί και κύτταρα που δε θα μπορούσαν να ληφθούν από ανθρώπους. Δυνατότητα διερεύνησης της επίδρασης ενός θρεπτικού συστατικού σε ζώα με παρόμοιο γενετικό υπόβαθρο Εισαγωγή μιας απομονωμένης (ξένης) γονιδιακής αλληλουχίας στο γενωμικό υλικό ενός ζώου. Τα ζώα αυτά λέγονται διαγονιδιακά και έχουν χαρακτηριστικά που κωδικοποιούνται από τα γονίδια αυτά. Η απαλοιφή (knock out) ενός συγκεκριμένου ενδογενούς γονιδίου.

Κριτήρια επιλογής το μέγεθος του ζώου το χρόνο που χρειάζεται για αναπαραγωγή ο αριθμός των απογόνων το κόστος στέγασης η δυνατότητα πραγματοποίησης αιμοληψίας και ζωοτομίας

Παραγωγή διαγονιδιακών ποντικών με υπερέκφραση ενός γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο ιστό Εισαγωγή ενός υποκινητή με ειδικότητα ιστού πριν από το ξένο γονίδιο. Η έκφραση εξαρτάται από την παρουσία ή την απουσία διατροφικών συστατικών όπως η τετρακυκλίνη. Έτσι, μπορεί να σταματήσει η έκφραση ενός γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο ιστό απομακρύνοντας (ή προσθέτοντας) τη τετρακυκλίνη από τη δίαιτα.

Κnockout πειραματόζωα N2KO ποντίκια ήταν τα πρώτα ζώα στα οποία στοχευμένη έλλειψη ενός νευρονικού μεταγραφικού παράγοντα προκάλεσε παχυσαρκία Σε ηλικία 8 εβδομάδων, τόσο το φυσιολογικό όσο και το knockout ποντίκι έχουν παρόμοιο βάρος και δομή σώματος. Η παχυσαρκία εμφανίζεται στις 12 εβδομάδες και τα ηλικιωμένα Nhlh2 knockout ζώα έχουν αυξημένο κοιλιακό λίπος και μεγαλύτερο σωματικό βάρος

PGC-1alpha (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha coactivator-1alpha) Ένας μεταγραφικός συν-ενεργοποιητής αλληλεπιδρά και ενεργοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στον κυτταρικό ενεργειακό μεταβολισμό και στη μιτοχονδριακή βιογέννεση. Αυξημένη έκφραση του PGC-1alpha σε ιστούς με έντονο μεταβολισμό

Καλλιέργειες ιστών Σε ιδανικές συνθήκες, τα κύτταρα μπορούν να επιβιώνουν, να πολλαπλασιάζονται και πιθανώς να διαφοροποιούνται μετά την απομόνωση. Οι καλλιέργειες ιστών χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: οργάνων και κυττάρων. Πλεόνεκτημα η απομίμηση του φυσιολογικού περιβάλλοντος, μειονέκτημα ο χρόνος επιβίωσης των καλλιεργειών οργάνων είναι περιορισμένος και γενικά δεν ξεπερνά τις 24 ώρες. Τα διαλύματα κυττάρων διαφέρουν από τις καλλιέργειες ιστών στο ότι το εξωκυττάριο υλικό και οι σύνδεσμοι μεταξύ των κυττάρων έχουν αποδιοργανωθεί. Οι καλλιέργειες κυττάρων που προέρχονται απευθείας από όργανα ή ιστούς ενός οργανισμού αναφέρονται ως πρωτογενείς καλλιέργειες.

Μοριακή κλωνοποίηση Μοριακή κλωνοποίηση είναι η διαδικασία παραγωγής τμημάτων DNA, τα οποία δεν αποτελούν απαραίτητα ένα πλήρες γονίδιο. Τα τμήματα αυτά μπορεί να αποτελούν μέρος γενωμικού DNA ή συμπληρωματικού DNA (cDNA) προερχόμενου από mRNA. Το τμήμα του DNA απομονώνεται και στη συνέχεια εισάγεται σε ένα ξενιστή. Ο ξενιστής ο οποίος περιέχει το ξένο DNA εισάγεται σε βακτηριακά κύτταρα. Ο ξενιστής έχει την ικανότητα να διπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα στο κύτταρο και τα κύτταρα αυτά μπορούν να πολλαπλασιάζονται παράγοντας έτσι τεράστιες ποσότητες από το τμήμα DNA που είχε αρχικά εισαχθεί.

Ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης: έκφραση του mRNA ενός γονιδίου Εφόσον υπάρχουν μικρές ποσότητες mRNA, τα δείγματα μεταφράζονται πρώτα σε cDNA με το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (RT). Για να γίνει δυνατή η ανίχνευση, το cDNA πρέπει να πολλαπλασιαστεί μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) Στις περισσότερες μεθόδους γίνεται απομόνωση ολικού RNA που αποτελείται από rRNA, mRNA και tRNA. Από το ολικό RNA μόνο το 5% περίπου είναι mRNA Καθώς τα ευκαρυωτικά κύτταρα περιέχουν φυσικές RNAάσες, χρησιμοποιούνται αναστολείς των RNAασών ώστε να αποφευχθεί η πέψη του απομονωμένου RNA. Το cDNA διαφέρει από το γενωμικό DNA στο ότι περιέχει μόνο τα εξόνια του DNA.

Οι μικροσυστοιχίες DNA (microarrays ή chips) Είναι ένα εργαλείο για την ανίχνευση διαφορών στην έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων σε ένα ή περισσότερα δείγματα μέσω μιας μόνο δοκιμασίας. Είναι χρήσιμες για τη καλύτερη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μεγάλου αριθμού γονιδίων και για τη μελέτη γεγονότων σε επίπεδο μεταγραφής.

Η ρύθμιση της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα Η έναρξη της μεταγραφής στους ευκαρυωτικούς εμφανίζει τέσσερις σημαντικές διαφορές από την αντίστοιχη διεργασία στα βακτήρια Η πρώτη διαφορά έγκειται στις ίδιες τις RNA πολυμεράσες. Η RNA πολυμεράση ΙΙ μεταγράφει τη μεγάλη πλειονότητα των ευκαρυωτικών γονιδίων Οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες απαιτούν τη βοήθεια μίας μεγάλης ομάδας πρωτεϊνών, που αναφέρονται ως γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες μπορεί να επηρεάσουν την έναρξη της μεταγραφής ακόμα και όταν είναι συνδεδεμένες στο DNA σε απόσταση χιλιάδων ζευγών νουκλεοτιδίων από τον υποκινητή Η έναρξη της μεταγραφής περιπλέκεται ακόμα περισσότερο από τη συσκευασία του DNA σε νουκλεοσώματα

Οι ρυθμιστικές πρωτείνες των ευκαρυωτικών γονιδίων ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων από κάποια απόσταση Οι θέσεις του DNA στις οποίες προσδένονται οι ενεργοποιητές των ευκαρυωτικών γονιδίων ονομάστηκαν αρχικά ενισχυτές (enhancers), επειδή η παρουσία τους αύξανε σημαντικά την ταχύτητα της μεταγραφής. Το 1979, προς μεγάλη έκπληξη των βιολόγων, ανακαλύφθηκε ότι αυτές οι ενεργοποιητικές πρωτεΐνες βρίσκονταν προσδεμένες σε απόσταση χιλιάδων ζευγών νουκλεοτιδίων μακριά από τον υποκινητή. Επιπλέον, οι ενεργοποιητές των ευκαρυωτικών μπορούσαν να επηρεάζουν τη μεταγραφή ενός γονιδίου ακόμα και όταν ήταν συνδεδεμένοι είτε πριν από το γονίδιο (σε ανοδική θέση) είτε μετά από αυτό (σε καθοδική θέση).

Μοντέλο για τον τρόπο λειτουργίας των ενισχυτών Το DNA που παρεμβάλλεται ανάμεσα στον ενισχυτή και τον υποκινητή διαμορφώνεται σε βρόχο, με συνέπεια οι πρωτεΐνες που βρίσκονται προσδεμένες στον ενισχυτή να έλθουν σε επαφή είτε με την RNA πολυμεράση είτε με κάποιον από τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες που είναι προσδεμένοι στον υποκινητή Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες που συνδέονται σε απομακρυσμένες ρυθμιστικές αλληλουχίες των γονιδίων μπορεί να αυξήσουν ή να ελαττώσουν την ενεργότητα της RNA πολυμεράσης που έχει προσδεθεί στον υποκινητή.

Σύγκριση της ρύθμισης των γονιδίων στα βακτήρια και τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς

Η συσκευασία του DNA του υποκινητή σε νουκλεοσωμάτια μπορεί να επηρεάσει την έναρξη της μεταγραφής Η παρουσία των νουκλεοσωματίων γενικά δεν παρακωλύει το στάδιο επιμήκυνσης της μεταγραφής, επειδή η RNA πολυμεράση μπορεί να διαπεράσει ένα νουκλεοσωμάτιο προκαλώντας μόνο μια παροδική διαταραχή στη δομή του. Τα νουκλεοσωμάτια μπορεί όμως να αναστείλουν την έναρξη της μεταγραφής αν βρίσκονται πάνω σ’ έναν υποκινητή, πιθανόν επειδή παρεμποδίζουν την πρόσδεση των γενικών μεταγραφικών παραγόντων ή της RNA πολυμεράσης στο DNA.

Ανθρώπινο γονίδο της β-σφαιρίνης Ανθρώπινο γονίδο της β-σφαιρίνης Παρουσιάζονται ορισμένες από τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες πιστεύεται ότι ελέγχουν την έκφραση αυτού του γονιδίου κατά την ανάπτυξη των ερυθροκυττάρων. Μερικές από αυτές, όπως η CP1 , βρίσκονται σε πολλά είδη κυττάρων. Αντίθετα άλλες όπως η πρωτεΐνη GATA-1 , υπάρχουν σε λίγα είδη κυττάρων (ανάμεσα τους και τα προγονικά κύτταρα των ερυθροκυττάρων) και γι’αυτό θεωρείται ότι συμβάλλουν στην έκφραση των γονιδίων της β-σφαιρίνης. Η παρουσία της πρωτεΐνης GATA-1 στις θέσεις δέσμευσης παρεμποδίζει την πρόσδεση άλλων πρωτεϊνών.

Η έκφραση διαφόρων γονιδίων μπορεί να συντονισθεί από μία πρωτεΐνη ‘Όταν ένα ευκαρυωτικό κύτταρο δεχθεί ένα σήμα, π.χ. για διαίρεση, τότε διάφορα γονίδια τα οποία προηγουμένως δεν εκφράζονταν ενεργοποιούνται όλα μαζί για να θέσουν σε λειτουργία τη σειρά των γεγονότων που οδηγούν τελικά στην κυτταρική διαίρεση. Μία μόνο ρυθμιστική πρωτείνη μπορεί να συντονίσει την έκφραση αρκετών διαφορετικών γονιδίων. Στην εικόνα αυτή αποδίδεται η δράση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών. Στο δεξιό μέρος της εικόνας φαίνεται η επίδραση που έχει η προσθήκη μίας επιπλέον ρυθμιστικής πρωτείνης (του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών ως σύμπλοκο με μία γλυκοκορτικοειδή ορμόνη) που προσδένεται στη ρυθμιστική περιοχή κάθε γονιδίου.

Ο συνδυαστικός έλεγχος δημιουργεί διαφόρους κυτταρικούς τύπους Πειραματική διαδικασία μετασχηματισμού ινοβλαστών από το δέρμα εμβρύου όρνιθας σε μυικά κύτταρα μετά από επιμόλυνση με το γονίδιο της πρωτείνης MyoD.