Φροντιστηριακό μάθημα ΙΙ Βιολογική Χημεία Ι Φροντιστηριακό μάθημα ΙΙ Γλυκογόνο Κύκλος Κιτρικού Οξέος Οξειδωτική φωσφορυλίωση Κλινικοί συσχετισμοί Δρ Αντώνης Γαργαλιώνης Ιατρός-Βιοπαθολόγος Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ

Παρουσίαση περιστατικού Ένας μουσικός 47 ετών παρουσίασε: - ακούσιες κινήσεις της γλώσσας και του προσώπου - αδεξιότητα στο αριστερό άνω και κάτω άκρο - δυσκολία στην κίνηση του αριστερού χεριού και ποδιού όταν έπαιζε ντραμς όσο και στη χρήση πνευστών οργάνων λόγω των ακούσιων κινήσεων της γλώσσας και του προσώπου • Τα επόμενα 5-10 χρόνια η κλινική εικόνα του επιδεινώθηκε: - Οι χοριοειδείς κινήσεις του προσώπου, της γλώσσας και του αριστερού άνω άκρου ελαττώθηκαν σημαντικά - Παρουσίασε στερεότυπες κινήσεις του αριστερού δείκτη όταν το χέρι του ακουμπά σε μια σταθερή επιφάνεια και παρόμοια στερεότυπη κίνηση του αριστερού ποδιού όταν κάθεται - Ανέπτυξε ένα περίεργο τρέκλισμα, ασταθές βήμα, το οποίο δεν είναι τυπικό εκφυλισμού της παρεγκεφαλίδας και δυσαρθρία λόγω ελαττωμένης κίνησης της γλώσσας - Στο δεξιό άνω άκρο ανέπτυξε ήπια βραδυκινησία - Παρουσίασε έντονη κατάθλιψη, έχασε πολύ βάρος και έκανε μία απόπειρα αυτοκτονίας

Βίντεο ασθενή (http://www. interscience. wiley Βίντεο ασθενή (http://www.interscience.wiley.com/jpages/0885-3185/suppmat. ) suppmat_mellick.mpg

Διάγνωση Απεικονιστικός έλεγχος -Magnetic Resonance Imaging (MRI) - Aπεικόνιση Mαγνητικού Συντονισμού Εργαστηριακός έλεγχος - Αιματολογική εξέταση - Ανάλυση εγκεφαλονωτιαίου υγρού - Ανάλυση ούρων - Ανάλυση ενζυμικής λειτουργικότητας - Γενετικές μελέτες

MRI video (http://www.mayoclinic.com/health/mri/MM00395)

Απεικονιστικός έλεγχος Magnetic resonance Imaging (MRI) - Η απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού δείχνει αλλοιώσεις στον τελεγκέφαλο (τελικό εγκέφαλο), συγκεκριμένα στο κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα, και στην ωχρά σφαίρα των δυο ημισφαιρίων (σημαντικά για τον κινητικό έλεγχο)

Εργαστηριακός έλεγχος Αιματολογική εξέταση -Υψηλά επίπεδα γαλακτικού και πυροσταφυλικού οξέος στο αίμα (>5.0 mmol/L) με ή χωρίς γαλακτική οξέωση → υποδηλώνουν γενετικό εκ γενετής λάθος του μεταβολισμού σε μιτοχονδριακό επίπεδο • Ανάλυση εγκεφαλονωτιαίου υγρού - Υψηλά επίπεδα γαλακτικού και πυροσταφυλικού οξέος Ανάλυση ούρων - Οι αναλύσεις ούρων για αμινοξέα αποκάλυψαν υπεραλανιναιμία Ανάλυση ενζυμικής λειτουργικότητας - Απομόνωση και καλλιέργεια ινοβλαστών δέρματος για μελέτη ενζυμικής λειτουργίας του συμπλόκου της πυροσταφυλικής δεϋδρογονάσης, έδειξε ανεπάρκεια του ενζύμου Ε1 Γενετικές μελέτες - Το χρωμοσωμικό DNA, που απομονώθηκε από τα λευκοκύτταρα σε δείγμα ολικού αίματος, εξετάστηκε στην αλληλουχία του για μεταλλάξεις στο γονίδιο της πυροσταφυλικής δεϋδρογονάσης, PDH 7

Κύκλος του Κιτρικού οξέος-Ανασκόπηση (http://www. youtube. com/watch Κύκλος του Κιτρικού οξέος-Ανασκόπηση (http://www.youtube.com/watch?v=hw5nWB0xN0Y)

Ανεπάρκεια του Συμπλόκου της Δεϋδρογονάσης του Πυροσταφυλικού (ΑΔΠ) Η πιο συχνή νευροεκφυλιστική διαταραχή που οφείλεται σε ανώμαλο μιτοχονδριακό μεταβολισμό Το σύμπλοκο της πυροσταφυλικής δεϋδρογονάσης μετατρέπει το πυροσταφυλικό σε ακέτυλο-συνένζυμο Α (CoA), απαραίτητο υπόστρωμα για την παραγωγή κιτρικού οξέος Ανεπάρκεια σε αυτό το ενζυμικό σύμπλοκο περιορίζει την παραγωγή κιτρικού, ο κύκλος δε μπορεί να προχωρήσει Για να παραχθεί ακετυλο συνένζυμο Α ενεργοποιούνται εναλλακτικά μεταβολικά μονοπάτια. Παρ’ όλα αυτά παραμένει ένα ενεργειακό έλλειμμα, κυρίως στο ΚΝΣ Λόγω της αδυναμίας μετατροπής του πυροσταφυλικού σε ακετυλο-συνένζυμο Α (CoA), η διαδικασία μετατοπίζεται προς άλλα μονοπάτια τα οποία παράγουν γαλακτικό οξύ και αλανίνη

Παθοφυσιολογία Ενζυμικές ανεπάρκειες μπορούν να οδηγήσουν σε συγγενείς ανωμαλίες διάπλασης του εγκεφάλου λόγω έλλειψης ενέργειας κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του νευρικού συστήματος Μη ειδικά αλλά κοινά συμπτώματα των μεταβολικών ασθενειών είναι τα ακόλουθα: - Υποθρεψία - Υπνηλία - Γρήγορη αναπνοή (ταχύπνοια) Μη ειδικά αναπτυξιακά σημεία της μεταβολικής νόσου είναι τα ακόλουθα: - Διανοητική καθυστέρηση - Ψυχοκινητική καθυστέρηση - Καθυστέρηση της ανάπτυξης Προοδευτική νευρολογική επιδείνωση ποικίλει σε νεογέννητα με φαινομενικά υγιή εγκέφαλο. Μπορεί να εκδηλωθούν απομυελίνωση, κυστικές βλάβες, και γλοίωση του φλοιού ή της παρεγκεφαλίδας, με εκφύλιση της φαιάς ουσίας ή νεκρωτική εγκεφαλοπάθεια Αναπνευστικά συμπτώματα (Άπνοια, Δύσπνοια, Αναπνευστική καταστολή) είναι χαρακτηριστικά της νευρολογικής νόσου και της σοβαρής γαλακτικής οξέωσης Η πιο συχνή μορφή ΑΔΠ προκαλείται από μεταλλάξεις στο Ε1 άλφα γονίδιο του Χ χρωμοσώματος 10

Το Σύμπλοκο της Δεϋδρογονάσης του Πυροσταφυλικού (ΡDΗ) αποτελείται από 3 ένζυμα Δεϋδρογονάση του πυροσταφυλικού (Ε1) Τρανσακετυλάση του διϋδρολιποϊκού (Ε2) Δεϋδρογονάση του διϋδρολιποϊκού (Ε3) Στο Ε1 προσδένει το συνένζυμο ΤΡΡ (πυροφωσφορική θειαμίνη) Στο Ε2 προσδένει ομοιοπολικά το λιποϊκό οξύ Στο Ε3 προσδένουν τα συνένζυμα NAD, FAD

Γενετική της Δεϋδρογονάσης του Πυροσταφυλικού Η ΑΔΠ χαρακτηρίζεται από: - Δυσλειτουργία και των 3 ενζύμων επεξεργασίας του υποστρώματος - Δυσλειτουργία της εξαρτώμενης από το Ε1α ένζυμο πρωτεΐνης Χ και θειαμίνης Η δυσλειτουργία της ενζυμικής υπομονάδας Ε1α είναι η πιο συχνή Η υπομονάδα του γονιδίου Ε1α τοποθετείται στο Xp22.2-p22.1. Περισσότερες από 90 μεταλλάξεις της ενζυμικής υπομονάδας Ε1α βλάπτουν είτε την πολυπεπτιδική σταθερότητα ή την καταλυτική αποτελεσματικότητα Ανεπάρκεια του λιποϊκού οξέος, του συμπαράγοντα του ενζύμου Ε2, έχει περιγραφεί μαζί με την ανεπάρκεια του ενζύμου Ε2 Το ένζυμο Ε3 χαρτογραφείται στο 7q31-32 και εμφανίζει αυτοσωμικό και υπολειπόμενο τρόπο κληρονομικότητας

Μοριακές τεχνικές εντοπισμού των μεταλλάξεων της υπομονάδας Ε1 στο DNA του ασθενούς Τεχνική Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (Polymerase Chain reaction-PCR) Ανάλυση της αλληλουχίας του DNA του ασθενούς (DNA sequencing)

PCR technique (http://www. dnatube

PCR technique

Αποτελέσματα τεχνικής PCR για τον ασθενή LA-31a Ανάλυση της μετάλλαξης στον LA-31a με ασύμμετρη PCR. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε με τους εκκινητές PDH-Z1 και PDHZ2. Η λωρίδα S113 εμφανίζει τον φυσιολογικό μάρτυρα. H λωρίδα LA-31a δείχνει το DNA ινοβλάστη του ασθενούς. Το μέγεθος του κομματιού του σημασμένου μάρτυρα φαίνεται στα αριστερά και το μέγεθος των PCR προϊόντων φαίνεται στα δεξιά.

DNA sequencing (http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM)

Automated Sequencing

Ανάλυση της αλληλουχίας του DNA Ανάλυση αλληλουχίας DNA της μετάλλαξης στον ασθενή LA-31a. H αλληλουχία DNA ενός φυσιολογικού μάρτυρα φαίνεται στα αριστερά και η αλληλουχία του διαγεγραμμένου γονιδίου στον ασθενή LA-31a φαίνεται στα δεξιά. Η έλλειψη των 7 ζευγών βάσεων περικλείεται στην αλληλουχία ελέγχου

Θεραπεία ασθενών με ΑΔΠ Χορήγηση συμπληρωμάτων διατροφής με συνένζυμα όπως η θειαμίνη, καρνιτίνη και λιποϊκό οξύ είναι η ενδεδειγμένη θεραπεία προκειμένου να βελτιωθεί τη λειτουργία της δεϋδρογονάσης του πυροσταφυλικού Κετογόνες δίαιτες (ελάττωση των προσλαμβανόμενων υδατανθράκων) έχουν χρησιμοποιηθεί για την αποτροπή της γαλακτικής οξέωσης χωρίς επιτυχία Το φάρμακο Dichloroacetate ελαττώνει την ανασταλτική φωσφορυλίωση της πυροσταφυλικής δεϋδρογονάσης Η χορήγηση κιτρικών από το στόμα χρησιμοποιείται συχνά για την αντιμετώπιση της οξέωσης

Μιτοχονδριακές μυοπάθειες: Παρουσίαση περιστατικού Μιτοχονδριακές μυοπάθειες: Παρουσίαση περιστατικού Ένα αρσενικό βρέφος είχε εκ γενετής σοβαρή μυϊκή υποτονία, επαναλαμβανόμενους εμέτους με αποτέλεσμα αφυδάτωση και βαριά μεταβολική οξέωση Αυξημένα επίπεδα γαλακτικού (έως 12.3 mmol/l), πυροσταφυλικού (0.4 mmol/l) και αλανίνης βρέθηκαν στον ορό με μια ανώμαλη παθολογική αναλογία γαλακτικού/πυροσταφυλικού (>30) Στα ούρα η συγκέντρωση του γαλακτικού, του πυροσταφυλικού, της αλανίνης και ποικίλων ενδιαμέσων του κύκλου του κιτρικού οξέος ήταν αυξημένα Το βρέφος παρουσίασε αυξανόμενη υπνηλία και πέθανε εξαιτίας σήψης σε ηλικία πέντε μηνών

Βιοψία μυός: Ιστολογικά ευρήματα Παθολογικά ευρήματα: Πλήθος ερυθρών ρακκωδών ινών (Ragged-red fiber) που περιέχουν υποσαρκειλημματικές συσσωρεύσεις μιτοχονδρίων, σταγονίδια λιπιδίων και γλυκογόνου Ισχυρή θετική χρώση πυροσταφυλικής δεϋδρογονάσης σε αιμοφόρα αγγεία Ευρήματα ηλεκτρονικού μικροσκοπίου: Ανώμαλος πολλαπλασιασμός των μιτοχονδρίων με παρακρυσταλλικά έγκλειστα

Mitochondria –physiology (http://www.youtube.com/watch?v=TgJt4KgKQJI)

Μιτοχονδριακές μυοπάθειες Νευρομυϊκές διαταραχές: προκύπτουν από ανωμαλίες της λειτουργίας του μιτοχονδρίου, το οποίο είναι υπεύθυνο για την εκπλήρωση των ενεργειακών αναγκών των ιστών Έχουν περιγραφεί μιτοχονδριακές ανωμαλίες που επηρεάζουν τον Kύκλο του Krebs (ανεπάρκεια φουμαράσης, ανεπάρκεια πυροσταφυλικής δεϋδρογονάσης) Οι πιο συχνές μιτοχονδριακές μυοπάθειες συνδέονται με ανωμαλίες της αναπνευστικής αλυσίδας Οι ασθενείς παρουσιάζουν συνήθως μυϊκά συμπτώματα όπως αδυναμία, άπνοια, δυσανεξία στην άσκηση, καρδιακή ανεπάρκεια, άνοια, συμπτώματα που προσομοιάζουν με αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, κώφωση, τύφλωση, επιληπτικές κρίσεις, πτώση βλεφάρων ή οφθαλμοπάθεια, και/ή εμέτους Αρχικά, οι μιτοχονδριακές μυοπάθειες αναγνωρίζονταν αποκλειστικά από τα κλινικά ευρήματα. Σήμερα, υπάρχουν γενετικές ερμηνείες που παρέχουν πρόσθετες πληροφορίες οι οποίες συμφωνούν με την κλινική διάγνωση και μπορούν, σε ορισμένες περιπτώσεις, να βοηθήσουν να καθοριστεί η μακροπρόθεσμη πρόγνωση 24

Παθολογικά αίτια Το πρωταρχικό ελάττωμα : μεταλλάξεις σε σημαντικά γονίδια τα οποία καθορίζουν (κωδικοποιούν) τη δομή πρωτεϊνών οι οποίες λειτουργούν στα μιτοχόνδρια Μεταλλάξεις μπορούν να βρεθούν στο DNA που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου. To DNA αυτό είναι γνωστό ως πυρηνικό DNA και θεωρείται από τους περισσότερους ανθρώπους ότι σχετίζεται με τις ανθρώπινες γενετικές ασθένειες, αλλά DNA βρίσκεται επίσης και στο μιτοχονδρικό γονιδίωμα Οι μιτοχονδριακές μυοπάθειες μπορούν να οφείλονται σε ελαττώματα στο πυρηνικό και στο μιτοχονδριακό DNA Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) είναι πολύ μικρότερο από το πυρηνικό DNA (nDNA). Το πυρηνικό DNA έχει περίπου 3.9 δισεκατομμύρια ζευγάρια βάσεων σε ολόκληρη την αλληλουχία του. Το mtDNA έχει μόνο 16.500 ζεύγη. Παρόλο που το mtDNA είναι πολύ μικρότερο σε μέγεθος, κάθε κύτταρο οπουδήποτε περιέχει από 2-100 μιτοχόνδρια και κάθε μιτοχόνδριο έχει 5-10 αντίγραφα του γονιδιώματός του Αντίθετα με το nDNA το οποίο είναι περιελιγμένο σε μια διπλή έλικα, το mtDNA έχει μια κυκλική δομή. Το μιτοχονδριακό DNA έχει επίσης έναν υψηλό μεταλλακτικό ρυθμό, σχεδόν 20 φορές αυτόν του nDNA

Mitochondrial Genome Mutations

◊ Η πολύπλοκη λειτουργία των συμπλόκων της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης μπορεί να διακοπεί από βλάβες στις υπομονάδες που κωδικοποιούνται από nDNA ή από mtDNA ή από βλάβες στην διαγενωμική επικοινωνία μεταξύ των δύο ◊ Τα προκαλούμενα ελλείμματα στην παραγωγή του ΑTP έχουν επιβλαβή αποτελέσματα σε έναν αριθμό οργανικών συστημάτων

Οι πιο συνήθεις μιτοχονδριακές μυοπάθειες: - NARP: νευροπάθεια, αταξία και μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια - KS: σύνδρομο Kearns-Sayre - Leigh's σύνδρομο - PEO: προϊούσα εξωτερική οφθαλμοπληγία - MILS: Σύνδρομο Leigh's κληρονομούμενο από τη μητέρα - MELAS: Μιτοχονδριακή μυοεγκεφαλοπάθεια, γαλακτική οξέωση και ισχαιμικού τύπου εγκεφαλικά επεισόδια - MERFF: μυοκλονική επιληψία με ερυθρές ρακκώδεις ίνες - Σύνδρομο Pearson - MNGIE: μιτοχονδριακή νευρο-γαστρο-εντερική εγκεφαλομυοπάθεια - LHON:κληρονομική οπτική νευροπάθεια του Leber

Κληρονομικότητα Το μιτοχονδριακό DNA κληρονομείται σχεδόν αποκλειστικά από το μητρικό γαμέτη (το ωάριο) Μεταλλάξεις ή αλλοιώσεις στο mtDNA μπορούν να μεταβιβαστούν από έναν μητρικό γαμέτη σε όλα τα παιδιά της μητέρας ανεξαρτήτως του φύλου

Διαγνωστικά κριτήρια • Τα διαγνωστικά κριτήρια των μιτοχονδριακών μυοπαθειών περιλαμβάνουν: τη φαινοτυπική εκτίμηση (ή εκτίμηση των παρατηρούμενων χαρακτηριστικών), συνοδευόμενη από εργαστηριακή εκτίμηση. ● Η κλινική διάγνωση μπορεί να επιβεβαιωθεί με εργαστηριακές μελέτες, βιοψία μυός, και μοριακή γενετική ανάλυση, στην οποία ο γενετιστής αναλύει το mtDNA. ● Σε απουσία ειδικών κλινικών κριτηρίων χαρακτηριστικών μιας μιτοχονδριακής μυοπάθειας, μετρούνται στον ορό ή στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος, κετοσώματα, ακυλοκαρνιτίνες πλάσματος, και οργανικά οξέα στα ούρα - Αυτοί είναι μεταβολίτες που συνήθως είναι μη φυσιολογικοί σε άτομο με μιτοχονδριακή μυοπάθεια. Αν δεν είναι φυσιολογικοί, εκτελείται βιοψία μυός. Η μοριακή γενετική εξέταση μπορεί συχνά να επιβεβαιώσει μια κλινική διάγνωση με ή χωρίς θετικά εργαστηριακά αποτελέσματα 30

Θεραπεία Δεν υπάρχει ειδική θεραπεία για μιτοχονδριακές μυοπάθειες - η θεραπεία στοχεύει αποκλειστικά στην ελάττωση του πόνου και των συμπτωμάτων και τη βελτίωση της κινητικότητας - Τα φάρμακα έχουν στόχο να ελαττώσουν τα ειδικά συμπτώματα που παρουσιάζει κάθε ασθενής (σπασμολυτική αγωγή μπορεί να απαιτείται για παράδειγμα για ένα άτομο που εμφανίζει κρίσεις επιληψίας) - Διαιτητικά συμπληρώματα χρησιμοποιούνται συχνά παρότι δεν έχει ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα και η ασφάλειά τους σε μακροχρόνιες μελέτες. Η κρεατίνη, το συνένζυμο Q10 και η καρνιτίνη είναι φυσικά συμπληρώματα της διατροφής που θεωρείται ότι αυξάνουν την παραγωγή ATP Κλινικές δοκιμές – μελέτες Μέχρι το 2007, υπάρχουν λίγες κλινικές μελέτες για τη θεραπευτική αντιμετώπιση μιτοχονδριακών μυοπαθειών. Μια μελέτη αξιολογεί το ρόλο του φαρμάκου dichloroacetate στην ελάττωση των επιπέδων γαλακτικού οξέος σε ασθενείς με σύνδρομο MELAS. Η γαλακτική οξέωση έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με ανεπάρκεια των νευρικών και μυϊκών κυττάρων. Η ελάττωση των επιπέδων γαλακτικού οξέος μπορεί να αποτρέψει την εμφάνιση γαλακτικής οξέωσης Σε ορισμένες περιπτώσεις το μεταβολικό block μπορεί τουλάχιστον εν μέρει να παρακαμφθεί. Το ηλεκτρικό οξύ, ενδιάμεσο προϊόν του κύκλου του Krebs, δίνει ηλεκτρόνια στο σύμπλεγμα II, και είναι ικανό in vitro να υποστηρίξει τη μιτοχονδριακή αναπνοή παρουσία αναστολέων του συμπλέγματος Ι. Έτσι 2-6 g ηλεκτρικού οξέος μπορεί να είναι αποτελεσματικά σε ασθενείς με μεμονωμένες ή κύριες διαταραχές του συμπλέγματος Ι

Γνωσιακοί στόχοι της δεύτερης ενότητας Αποδόμηση γλυκογόνου – δράση 3 ενζύμων Είσοδος 6Ρ-γλυκόζη στους μυες και στο ήπαρ -2 διαφορετικοί οδοί Νουκλεοτιδοσάκχαρα –Τι είναι; Πως δημιουργούνται; Σύνθεση γλυκογόνου – Ποια ένζυμα εμπλέκονται; Γλυκογενίνη – Τι είναι; Πως δρα; Ρύθμιση διάσπασης/σύνθεσης γλυκογόνου (αλλοστερική, ορμονική) Κύκλος κιτρικού – ορισμός, που συμβαίνει, προιόντα Σύμπλοκο της δεϋδρογονάσης του πυροσταφυλικού –τι κάνει;κλινικές επιπτώσεις Περιγραφή αντιδράσεων του κύκλου Αναβολικές – Καταβολικές λειτουργίες Ρύθμιση του κύκλου Οξειδωτική φωσφορυλίωση – ορισμός, που συμβαίνει; Περιγραφή αναπνευστικής αλυσίδας Τι είναι το δυναμικό οξειδοαναγωγής; Πρωτονιοκινητική δύναμη – τι είναι; Χημειωσμωτικό μοντέλο (περιγραφή) Πως παράγεται ΑΤΡ; Δομή, λειτουργία ΑΤΡ συνθάσης Ρύθμιση οξειδ. Φωσφορυλίωσης Μιτοχονδριακό DNA – τι είναι; Κλινικοί συσχετισμοί Ελεύθερες ρίζες οξυγόνου – τι είναι; Πως αδρανοποιούνται στα μιτοχόνδρια;