Καρκίνος Ανδρέα Παόλα Ρόχας Χιλ Επίκουρη Καθηγήτρια Βιολογία- Βιοχημείας Τμήμα Νοσηλευτικής Πανεπιστήμιο Πελοποννήσου

Με τον όρο καρκίνο υποδηλώνουμε μια μεγάλη ομάδα ασθενειών που επηρεάζουν τον άνθρωπο και τα ζώα Τα κύρια χαρακτηριστικά του καρκίνου περιλαμβάνουν τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των ανώμαλων κυττάρων του σώματος με την προκύπτουσα μάζα να πιέζει, να διηθεί και να καταστρέφει τον συνεχιζόμενο φυσιολογικό ιστό Τα καρκινικά κύτταρα αποσπώνται ή αφήνουν την αρχική μάζα και μεταφέρονται από το αίμα ή τη λέμφο σε απομακρυσμένες περιοχές του σώματος όπου αρχίζουν δευτερογενείς αποικίες ή μεταστάσεις διηθώντας και καταστρέφοντας περαιτέρω τα όργανα που συμμετέχουν Χαρακτηριστικά καρκινικών κυττάρων Αναπλασία Αυτονομία

Ιστορική Αναδρομή Πρώτη περίοδος Δεύτερη περίοδος Τρίτη περίοδος 500 π.χ.-500 μ.χ. (από τον Ιπποκράτη στον Γαληνό) Δεύτερη περίοδος 500 μ.χ.-1500 μ.χ. Τρίτη περίοδος 16ος αιώνας-18ος αιώνας Pare΄, Vesalius, John Hunter, Percival Pott Τέταρτη περίοδος 19ος αιώνας (Johannes Muller) Πέμπτη περίοδος 20ος αιώνας Προβάλει η Ογκολογία σαν ανεξάρτητη επιστημονική ειδικότητα 1930 ακτινοθεραπεία 1960 χημειοθεραπεία 1977 ανακάλυψη ογκογονιδίων

είτε από την άμεση αύξηση στον παρακείμενο ιστό μέσω εισβολής Ο καρκίνος είναι μια ομάδα ασθενειών ή διαταραχών που χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτη διαίρεση κυττάρων και την δυνατότητα αυτών των κυττάρων να εισβάλουν σε άλλους ιστούς, είτε από την άμεση αύξηση στον παρακείμενο ιστό μέσω εισβολής είτε από την εμφύτευση σε απόμακρες περιοχές μέσω μετάστασης. Αυτή η ανεξέλεγκτη αύξηση προκαλείται από μεταλλάξεις στα γονίδια που ελέγχουν την κυτταροδιαίρεση. Διάφορες μεταλλάξεις μπορούν να απαιτηθούν για να μετασχηματίσουν ένα κανονικό κύτταρο σε ένα κακοήθες κύτταρο. Α - κανονική διαίρεση κυττάρων, Β - καρκινική διαίρεση κυττάρων 1 - απόπτωση, 2 - κατεστραμμένο κύτταρο.

Νεόπλασμα ονομάζεται ο αυτόνομος, άνομος και άτυπος πολλαπλασιασμός των κυττάρων μιας περιοχής του σώματος (καλόηθες ή κακόηθες). Επικρατέστερος ορισμός για το νεόπλασμα: Μια ανώμαλη μάζα που υπερβαίνει την ανάπτυξη των κανονικών ιστών, δεν συντονίζεται με αυτούς και εξακολουθεί να αυξάνεται κατά τον ίδιο πληθωρικό τρόπο και μετά την καταστολή του γενεσιουργού ερεθίσματος. Καρκίνος αφορά τις κακοήθεις νεοπλασίες του επιθηλιακού ιστού. Καρκινογένεση ονομάζεται η μετατροπή ενός υγιούς κυττάρου σε καρκινικό.

Παράγοντες Υπεύθυνοι για Καρκινογένεση Διατροφή Χημικές ουσίες Φάρμακα Ακτινοβολίες Ιοί

Χημικά Καρκινογόνα Χημικά καρκινογόνα ονομάζονται οι τοξικοί εκείνοι παράγοντες, που έχουν μια ειδική και καθορισμένη ανεπιθύμητη ενέργεια, την πρόκληση καρκίνου στα πειραματόζωα ή στον άνθρωπο

Καρκινογόνες Ουσίες Ως καρκινογόνες θεωρούνται οι ουσίες εκείνες που πληρούν ένα ή περισσότερα από τα εξής τέσσερα κριτήρια: - Προκαλούν όγκους, που δεν παρατηρούνται στην ομάδα ελέγχου - Αυξάνουν τους όγκους που παρατηρούνται στην ομάδα ελέγχου - Προκαλούν όγκους νωρίτερα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου - Αυξάνουν την πρόκληση πολλαπλών όγκων

Η εκδήλωση της καρκινογόνου δράσης μιας ουσίας είναι συνάρτηση: της ποσότητάς της (δόση του καρκινογόνου) τη διάρκεια έκθεσης σ΄αυτή τη συχνότητα έκθεσης σ΄αυτή

Στάδια Καρκινογένεσης Πρώτο στάδιο - ΕΝΑΡΞΗ: Μετατροπή του φυσιολογικού κυττάρου σε προκαρκινικό (μεταλλαγμένο) Δεύτερο στάδιο - ΠΡΟΑΓΩΓΗ: Μετατροπή του προκαρκινικού κυττάρου σε καρκινικό

Συν-καρκινογόνα Συν-καρκινογόνα (co-carcinogens) ονομάζονται οι ουσίες εκείνες που επάγουν την καρκινογόνο δράση ενός γονιδιοτοξικού καρκινογόνου, όταν χορηγούνται πριν ή συγχρόνως με αυτό ή όσο διαρκεί η βλάβη του DNA. Είναι «αθώες» χημικές ουσίες που συναντώνται στο περιβάλλον εργασίας.

Διαφορά του συν-καρκινογόνου από την προαγωγό ουσία Το συν-καρκινογόνο επιταχύνει τη μετατροπή του φυσιολογικού κυττάρου σε νεοπλασματικό. Οι «προαγωγοί» συμβάλλουν στην αύξηση και στον πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων.

DNA: Το πιθανότερο σημείο από το οποίο ξεκινάει ο καρκίνος. Δηλαδή, εσφαλμένη κωδικοποίηση –ανασυνδυασμοί - δημιουργία χασμάτων – μετάλλαξη. ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ: Κάθε απότομη μεταβολή του γενετικού υλικού, που προκαλείται ή αυτόματα ή υπό την επίδραση φυσικών και χημικών παραγόντων.

Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί του κυττάρου Σε βλάβες του DNA η σημαντικότερη επιδιόρθωση είναι η «εκτομή-επιδιόρθωση», ως εξής: Αναγνωρίζεται η βλάβη από τις γλυκοσιδάσες. Ακολουθεί εκτομή του τμήματος που υπέστη βλάβη με τις ενδονουκλεάσες. Οι πολυμεράσες συνθέτουν ένα νέο υγιές τμήμα. Το νέο υγιές τμήμα συνδέεται με λιγάσες στην άλυσο του DNA.

Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί του κυττάρου Αν δεν προλάβουν να δράσουν και το κύτταρο εισέλθει στη φάση του αναδιπλασιασμού, τότε θεωρούμε ότι έχει εισέλθει σε προκαρκινική κατάσταση και η εξαλλαγή των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά είναι πιθανή έως αναπόφευκτη.

Αντιδρώντα με το DNA (γονιδιοτοξικά καρκινογόνα) Είναι ηλεκτρονιόφιλες ουσίες ή γίνονται ηλεκτρονιόφιλες, μετά από μεταβολική ενεργοποίηση, δηλαδή είναι θετικά φορτισμένα μόρια που συνδέονται με ομοιοπολικό δεσμό με τα πυρηνόφιλα κέντρα του κυττάρου, όπως είναι το DNA, το RΝΑ, οι πρωτεΐνες, η γλουταθειόνη και πιθανώς οι πολυσακχαρίτες.

Επιγενετικά καρκινογόνα ονομάζονται εκείνα που δεν αντιδρούν με το DNA και τα οποία δρουν μέσω άλλων μηχανισμών: προκαλούν κυτταροτοξικότητα ή προκαλούν χρόνια βλάβη των ιστών ή προκαλούν ορμονικές διαταραχές ή επηρεάζουν το ανοσοποιητικό σύστημα ή δρουν ως προαγωγοί στην καρκινογένεση

Η καρκινογόνος δράση μιας ουσίας τροποποιείται με επαγωγή ή αναστολή της δράσης της από την παρουσία άλλων ενώσεων. Επαγωγή: Επιτελείται με προαγωγούς ή επιταχυντές του καρκίνου (co-carcinogens). Αναστολή: Επιτελείται με την επαγωγή των μικροσωμικών ενζύμων του ήπατος.

Ογκογόνοι Ιοί Ι. Ιοί με δίκλωνο DNA ΙΙ. Ιός της Ηπατίτιδας Β Ιός του Παπιλλώματος (HPV-16, HPV-18) Ιός του Έρπητα Αδενοιοί Ιός του Epstein-Barr Ιος του πολυώματος SV40 ΙΙΙ. Ρετροιοί ΙΙ. Ιός της Ηπατίτιδας Β

ΚΑΡΚΙΝΟΣ=ΝΟΣΟΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ

Τι είναι τα ογκογονίδια Ογκογονίδια Τι είναι τα ογκογονίδια Είναι ένας αλλαγμένος τύπος ενός κυτταρικού γονιδίου το οποίο ονομάζεται πρωτο-ογκογονίδιο Τα πρωτο-ογκογονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες που παίρνουν μέρος στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επάγοντας τον

Κατηγορίες Ογκογονιδίων 1. Γονίδια που κωδικοποιούν αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους erb-B Υποδοχέας του EGF Glioblastoma, Breast cancer erb-B2 Υποδοχέας του EGF Breast cancer, Ovarian cancer, Salivary gland cancer PDGF Αυξητικός Παράγοντας Glioma RET Αυξητικός Παράγοντας Thyroid cancer 2. Γονίδια που εκφράζουν κυτταροπλασματικούς διαβιβαστές σημάτων K-ras Protein kinase Lung cancer, Colon cancer, Ovarian cancer, Pancreatic cancer Ν-ras Protein kinase Leukemias Γονίδια που εκφράζουν μεταγραφικούς παράγοντες που ενεργοποιούν με την σειρά τους την έκφραση γονιδίων αυξητικών παραγόντων 3. c-myc Μεταγραφικός Παράγοντας Lung cancer, Breast cancer, Stomach cancer L-myc Μεταγραφικός Παράγοντας Lung cancer N-myc Μεταγραφικός Παράγοντας Neuroblastoma 4. Γονίδια αντι-αποπτωτικών παραγόντων bcl-2 αντι-αποπτωτικός παράγοντας Follicular B cell lymphoma bcl-1 αντι-αποπτωτικός παράγοντας Breast cancer; head and neck cancers

Ογκοκατασταλτικά γονίδια Τι είναι τα ογκοκατασταλτικά γονίδια Τα γονίδια εκείνα, των οποίων τα προϊόντα ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, καταστέλλοντας τον

Κατηγορίες Ογκοκατασταλτικών γονιδίων 1. Γονίδια που κωδικοποιούν κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες APC αντι-μιτογόνο δράση Colon cancer, Stomach cancer DPC4 αντι-μιτογόνο δράση Pancreatic cancer NF-1 αντι-μιτογόνο δράση Neurofibroma, Myeloid leukemia 2. Γονίδια που κωδικοποιούν πυρηνικές πρωτεΐνες MTS1 αντι-μιτογόνο δράση (p16) Διάφοροι τύποι καρκίνου p53 αντι-μιτογόνο δράση Διάφοροι τύποι καρκίνου Rb αντι-μιτογόνο δράση Retinoblastoma, Breast cancer, Bone cancer, Bladder cancer 3. Άλλα γονίδια BRCA1 ? Breast cancer, Οvarian cancer BRCA2 ? Breast cancer VHL ? Renal cell cancer

ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΝΟΧΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ Α) ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ Οι αλλαγές των κωδικίων (τριάδα νουκλεοτιδίων) μπορούν να οδηγήσουν στην δημιουργία των ογκογονιδίων, που είναι συστατικά των κυττάρων, που αποτελούνται από μία αλληλουχία γονιδίων και σε φυσιολογική κατάσταση βρίσκονται σε καταστολή, ενεργοποιούνται όμως όταν συμβούν μεταλλάξεις. Τα περισσότερα ογκογονίδια διαταράσσουν το φυσιολογικό ρυθμό ανάπτυξης και διαφοροποίησης των κυττάρων.

Β) ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ Καταστέλλουν τη δράση των ογκογονιδίων. Αν τα ογκοκατασταλτικά γονίδια εξουδετερωθούν με απάλειψη ή μετάλλαξη, επέρχεται επαγωγή της καρκινογένεσης.

ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚO ΓΟΝΙΔΙΟ p53 Δίνει εντολή στα ελαττωματικά κύτταρα να αυτοκαταστραφούν. Συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA. Θεωρείται καρκινικός δείκτης σε διάφορους τύπους νεοπλασμάτων. Η πρωτεΐνη p53 κωδικοποιείται από το γονίδιο αυτό. Το γονίδιο p53 είναι ο μοριακός φύλακας του γονιδιώματος. Κάθε γενετική βλάβη στο γονίδιο p53 , οδηγεί στην ανάπτυξη καρκίνου.

Cdk2, Cdk4 Cyclin D, E Επάγονται από Αυξητικούς Παράγοντες

ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ Με τον όρο «διαφοροποίηση» του νεοπλασματικού κυττάρου νοείται ο βαθμός ομοιότητάς του με το φυσιολογικό από το οποίο προέρχεται, μορφολογικά και λειτουργικά και ο βαθμός αυτός είναι αντιστρόφως ανάλογος από το ρυθμό πολλαπλασιασμού του. Τα καλοήθη νεοπλάσματα είναι καλά διαφοροποιημένα.

ΘΕΩΡΙΑ 1η : «Η ΣΤΑΘΕΡΗ ΘΕΩΡΙΑ» Καρκινογόνα όπως η υπεριώδης ακτινοβολία και ο καπνός, τροποποιούν απευθείας την αλληλουχία του DNA στα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Μεταλλάξεις σε ογκοκατασταλτικά γονίδια προκαλούν την εξαφάνιση των πρωτεϊνών που αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων και κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια, επιτρέποντας στα κύτταρα να επιβιώνουν και να συνεχίζουν να διαιρούνται ενώ δε θα έπρεπε. Ταυτόχρονα, μεταλλάξεις σε ογκογονίδια κάνουν τις ογκοπρωτείνες να γίνονται υπερδραστήριες, ωθώντας το κύτταρο να αναπτύσσεται σε καταστάσεις στις οποίες κανονικά δε θα αναπτύσσονταν.

ΘΕΩΡΙΑ 2η: «ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΘΕΩΡΙΑ» Κάτι αδρανοποιεί ένα ή περισσότερα γονίδια που είναι απαραίτητα για την ακριβή σύνθεση και επιδιόρθωση του DNA. Καθώς τα κύτταρα διαιρούνται συμβαίνουν τυχαίες μεταλλάξεις οι οποίες δεν επιδιορθώνονται κι έτσι συσσωρεύονται σε δεκάδες χιλιάδες. Τελικά δέχονται πλήγμα και τα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Όπως και στη βασική θεωρία, η εξάλειψη των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών και η ενεργοποίηση των ογκοπρωτεϊνών βραχυκυκλώνουν τους μηχανισμούς αυτοκαταστροφής του κυττάρου έτσι ώστε να μην μπορεί να «αυτοκτονήσει».

ΘΕΩΡΙΑ 3η: «ΠΡΩΙΜΗ ΑΣΤΘΕΙΑ» Κάτι «σιγάζει» ένα ή περισσότερα κύρια γονίδια που απαιτούνται για την κυτταρική διαίρεση. Καθώς τα χρωμοσώματα διπλασιάζονται, συμβαίνουν λάθη. Κάποια θυγατρικά κύτταρα παίρνουν το λάθος αριθμό των χρωμοσωμάτων ή χρωμοσώματα που τους λείπουν άκρα ή έχουν παραπανίσια τμήματα. Οι ανωμαλίες χειροτερεύουν σε κάθε γενιά. Η ποσότητα των γονιδίων στο κύτταρο αλλάζει και χρωμοσωμικά τμήματα προστίθενται ή εξαφανίζονται. Εν καιρώ, η ποσότητα των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών πέφτει κάτω από ένα κρίσιμο όριο και επιπλέον αντίγραφα ογκογονιδίων μπορούν να αυξήσουν την ποσότητα των ογκοπρωτεϊνών σε επικίνδυνα επίπεδα.

ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ Η κατάληξη αυτή είναι κοινή για τις 3 πρώτες θεωρίες Η υπερβολική ποσότητα των ογκοπρωτεϊνών και η έλλειψη ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών οδηγούν τα μεταλλαγμένα κύτταρα σε υπέρμετρη αναπαραγωγή. Μετά από πολλούς γύρους μεταλλάξεων και επεκτάσεων, ένα κύτταρο από τη μάζα των μεταλλαγμένων, σπάει όλους τους περιορισμούς της ανάπτυξής του. Η αποικία εισβάλλει σε γειτονικό ιστό στο όργανο ξενιστή. Στα πιο προηγμένα στάδια της εξέλιξής του, τα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν στην κυκλοφορία του αίματος. Αυτά τα μεταστατικά κύτταρα σχηματίζουν νέες αποικίες σε απομακρυσμένα σημεία του σώματος, εμπλεκόμενα τελικά σε ζωτικές λειτουργίες.

ΘΕΩΡΙΑ 4η: « ΟΛΙΚΗ ΑΝΕΥΠΛΟΪΔΙΑ» 1. Ένα λάθος κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης παράγει ανευπλοειδή κύτταρα. 2. Τα λάθος τοποθετημένα ή ακρωτηριασμένα χρωμοσώματα αλλάζουν τις σχετικές ποσότητες χιλιάδων γονιδίων. Ομάδες ενζύμων που φυσιολογικά συνεργάζονται για να αντιγράψουν ή να επιδιορθώσουν το DNA αρχίζουν να λιγοστεύουν. Ως αποτέλεσμα, όλο και περισσότερα ανευπλοειδή κύτταρα πεθαίνουν. 3. Όμως μερικά επιβιώνουν και δημιουργούν επίσης ανευπλοειδείς απογόνους…. (Δε φαίνεται στη φωτοτυπία) 4. Τελικά ένα ή περισσότερα κύτταρα αποκτούν ένα συνδυασμό από ανώμαλα χρωμοσώματα που μεταβιβάζουν μία ή περισσότερες από τις «υπερδυνάμεις» του καρκίνου. Τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται σε ένα προκαρκινικό όγκο. 5. Εξελισσόμενα κατά τη διάρκεια των ετών ή των δεκαετιών, τα κύτταρα σταδιακά αποκτούν την ικανότητα να εισβάλλουν σε γειτονικό ιστό διαφορετικών τύπων.

ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΗ ΚΥΤΤΑΡΑ Αρχικά ο όρος ανευπλοϊδία χρησιμοποιούνταν μόνο για κύτταρα με μη φυσιολογικό αριθμό χρωμοσωμάτων. Πρόσφατα όμως άρχισε να χρησιμοποιείται με μια πιο διευρυμένη έννοια, που περιλαμβάνει επίσης χρωμοσώματα με περικοπές, προεκτάσεις και ανταλλαγές χρωμοσωμάτων.

Θεραπευτικές Μέθοδοι Χειρουργική επέμβαση Ακτινοθεραπεία Κυτταροτοξική Χημειοθεραπεία Βιοθεραπεία Γονιδιακή Θεραπεία Θεραπεία με RNA interference (RNAi)

Γονιδιακή Θεραπεία Στόχοι Διόρθωση της γενετικής βλάβης εισάγοντας στους ασθενείς φυσιολογικά αλληλόμορφα του μεταλλαγμένου γονιδίου Προσδιορισμός των κυττάρων που εμφανίζουν τη βλάβη

Η Γονιδιακή Θεραπεία έγινε πραγματικότητα στις 14 -9- 1990

Τι είναι η Γονιδιακή Θεραπεία ? Μία προσέγγιση Μοριακής Ιατρικής που περιλαμβάνει μεταφορά γονιδίων με στόχο την επίτευξη και διατήρηση του σωστού επιπέδου μίας λειτουργικής πρωτεϊνης, που ενέχεται σε μία ασθένεια, σε όλη τη ζωή του ατόμου

Θεραπευτική Προσέγγιση όπου το φάρμακο δεν είναι πρωτεϊνη ή άλλο σκεύασμα, αλλά ένα τμήμα γενετικού υλικού: ένα τμήμα DNA

Η ιδέα γεννήθηκε εδώ και μισό αιώνα περίπου, όταν έγινε κατανοητός όταν έγινε κατανοητός ο τρόπος που οι ιοί μολύνουν τα κύτταρα : στέλνοντας το γενετικό του υλικό μέσα στα κύτταρα-στόχο που μολύνουν

Πώς γίνεται η Γονιδιακή Θεραπεία? Α. Στρατηγικές & Στόχοι

Στρατηγικές Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo ως προς τον στόχο αρχικές προσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις Αναστολή της έκφρασης γονιδίου Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP

Γονιδιακή Θεραπεία in vivo ex vivo

Στρατηγικές Ως προς τη Μεταφορά στον Άνθρωπο: in vivo, ex vivo Ως προς την ασθένεια αρχικές προσεγγίσεις Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου Επιλεκτική θανάτωση των κυττάρων της ασθένειας νεώτερες προσεγγίσεις Αναστολή της έκφρασης γονιδίου Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP

Ασθένειες που οφείλονται σε ελάττωση ή έλλειψη μιας πρωτείνης

2.Καρκίνος

X 4. Επίδραση στον γονότυπο με τεχνητά μόρια, ZFP : κληρονομικές ασθένειες Γονίδιο–στόχος με μετάλλαξη X Μεταφορά Τεχνητού μορίου ZFP, το οποίο επάγει θραύση Δράση του διορθωτικού μηχανισμού του κυττάρου Διόρθωση με βάση τη σωστή αλληλουχία Αποκατάσταση !!

Πώς γίνεται η Γονιδιακή Θεραπεία? Β. Φορείς ή οχήματα

Γονιδιακή Θεραπεία

Ο ιδανικός φορέας πρέπει να εξασφαλίζει μεγάλη διαμολυσματική ικανότητα για διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα στόχευση στα κατάλληλα κύτταρα συνεχή και ρυθμιζόμενη έκφραση του διαγονιδίου

Ο ιδανικός φορέας πρέπει να μην προκαλεί ανοσολογική αντίδραση μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA λόγω ενσωμάτωσης και τέλος πρέπει: Να είναι δυνατή η μαζική παραγωγή του εύκολα και επαναλήψιμα

Φορείς γονιδιακής μεταφοράς ρετρο-ιϊκοί (RV) αδενο-ιϊκοί (AV) ιϊκοί φορείς adeno-associated (AAV) ηλεκτροδιάτρηση φυσικές μέθοδοι “gene-gun” microinjection μη ιϊκοί φορείς Πλασμίδια επισώματα κατιονικά λιπίδια χημικές μέθοδοι κατιονικά πεπτίδια κατιονικά πολυμερή

Vector Insert Ability to Titers Major advantages Major limitations Insert size (kb) Ability to integrate Titers (tu/ml)a Major advantages Major limitations MMLV Yes 106 Stable transfection of dividing cells Infects rapidly dividing cells best HIV-1-based lentivirus 106-107 Able to infect dividing and non-dividing cells Conversion to HIV-1 and possible recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response 30 107 Low toxicity and immunogenicity Hard to produce AAV 109 Stable transfection, low toxicity and immunogenicity Small insert size HSV 1011 Large transgene capacity, high titers HSV amplicon Large transgene capacity, low toxicity and immunogenicity Relatively low titers Vaccinia NA Large transgene capacity, cytoplasmic expression Limited to non-small pox vaccinated or immunocompetent individuals Vector Insert size (kb) Ability to integrate Titers (tu/ml)a Major advantages Major limitations MMLV Yes 106 Stable transfection of dividing cells Infects rapidly dividing cells best HIV-1-based lentivirus 106-107 Able to infect dividing and non-dividing cells Conversion to HIV-1 and possible recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response 30 107 Low toxicity and immunogenicity Hard to produce AAV 109 Stable transfection, low toxicity and immunogenicity Small insert size HSV 1011 Large transgene capacity, high titers HSV amplicon Large transgene capacity, low toxicity and immunogenicity Relatively low titers Vaccinia NA Large transgene capacity, cytoplasmic expression Limited to non-small pox vaccinated or immunocompetent individuals Vector Insert size (kb) Ability to integrate Titers (tu/ml)a Major advantages Major limitations MMLV Yes 106 Stable transfection of dividing cells Infects rapidly dividing cells best HIV-1-based lentivirus 106-107 Able to infect dividing and non-dividing cells Conversion to HIV-1 and possible recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response 30 107 Low toxicity and immunogenicity Hard to produce AAV 109 Stable transfection, low toxicity and immunogenicity Small insert size HSV 1011 Large transgene capacity, high titers HSV amplicon Large transgene capacity, low toxicity and immunogenicity Relatively low titers Vaccinia NA Large transgene capacity, cytoplasmic expression Limited to non-small pox vaccinated or immunocompetent individuals 8 8 8 10 10 10 7.5 Vector Insert Ability to Titers Major advantages Major limitations size (kb) integrate (tu/ml)a MMLV < 8 Yes 106 Stable transfection Infects rapidly of dividing cells dividing cells best HIV-1- <10 Yes 106-107 Able to infect Conversion to based dividing and HIV-1 and possible lentivirus non-dividing cells recombination with human endogenous retroviruses (HERVs) Ad <7.5 No 1012 High titers Transient expression, triggers immune response Gutted Ad 30 No 107 Low toxicity and Hard to produce immunogenicity AAV <4.5 Yes 109 Stable transfection, Small insert size low toxicity and HSV <30 No 1011 Large transgene Transient expression, capacity, high titers triggers immune response Ad 30 30 30 50 50 50 25 25 25

Ιϊκοί φορείς : το μεγαλύτερο ποσοστό οχημάτων gene

Viral Vectors High efficiency of transduction Oncoretroviral Vectors : Murine Leukemia Virus in 60% of all approved clinical protocols BUT Low titers Only dividing cells Adenovirus Vectors : Human, infect all cells including nondividing Cells. Used extensively in Cystic Fibrosis, Does not integrade Low expression level Immune response Second Generation adenovirus vectors “gutless vectors”

Viral Vectors Συνέχεια Adeno-associated virusVectors : ssDNA, integration, on 19q13.3-qter 96% of parental AAV genome deleted BUT up to 4.5 kb insert. Herpes simplex virus Vectors (HSV): Lifelong latent infections in neurons, Nonintegrating Lentiviruses (complex retroviruses including HIV) : tranduce nondividing cells Safety ??

J. Gene Med.

σε κλινικές δοκιμές με ιικά συστήματα 2. Μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA Κύρια προβλήματα σε κλινικές δοκιμές με ιικά συστήματα 2. Μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA 2002 : Ανάπτυξη λευχαιμίας σε δύο παιδιά με X-SCID κατά την κλινική δοκιμή με Ad ιικό σύστημα Λόγω ενσωμάτωσης δίπλα και μέσα στο ογκογονίδιο LMO2 Ωστόσο With X-SCID study , “gene therapy” rises to a level of rigorous clinical research with quantifiable risk/benefit ratio, a new epoch for human genetics Theodore Friedman ESGT Nov.2004

κλινικής δοκιμής με Ad ιικό σύστημα. Κύρια προβλήματα σε κλινικές δοκιμές με ιικά συστήματα Ανοσολογική αντίδραση η τοξικότητα 1999 : Ο θάνατος του Jess Gelsinger κατά την διάρκεια κλινικής δοκιμής με Ad ιικό σύστημα. Έπασχε από : OTC deficiency, Ανεπάρκεια της τρανσκαρβαμυλάσης της ορνιθίνης Πέθανε από : «multiple-organ-system failure» Dr. Harold Varmus, the director of the ΝΙΗ : "Gene therapy is not yet therapy."

Υβριδικοί Ιικοί φορείς Σχεδιασμός Replication deficient Replication conditioned “gutted” and hybrid vectors με απαλοιφή των μη-απαραίτητων η τοξικών γονιδίων ή με ενσωμάτωση στοιχείων που ενισχύουν την γονιδιακή μεταφορά in vivo. 4. Χρήση ιστοειδικών υποκινητών για την ρύθμιση της έκφρασης του διαγονιδίου

Τρέχουσα έρευνα για την αντιμετώπιση των προβλημάτων των ιικών φορέων Οι νεώτερης γενιάς ιϊκοί φορείς έχουν τις ελάχιστες δυνατές ιϊκές πρωτεϊνες και φέρουν τροποποιήσεις στις LTR Γίνεται εκτεταμένη ανάλυση του γονιδιώματος μετά την ενσωμάτωση προκειμένου να προσδιοριστούν οι ειδικές θέσεις ενσωμάτωσης για κάθε ιϊκό σύστημα, εφ’όσον υπάρχουν 3. Αναπτύσσονται μη ιϊκά συστήματα μεταφοράς γονιδίων

Μη Ιικοί φορείς Τεχνητά χρωμοσώματα Επισωματικοί φορείς

S/MAR- based HAC EBV-based

pEPI-2, a chromosome-based vector S/MAR: Scaffold/matrix attachment region Lipps and Co., Nucleic Acids Res, 1999

Κλινικές δοκιμές

J. Gene Med.

J. Gene Med.

Παρόλα αυτά η ΓΘ δεν είναι ακόμα θεραπεία: δεν συνταγογραφείται πουθενά στον κόσμο Είναι έρευνα, πολλά υποσχόμενη!

Δεν είναι αποδεκτή η επέμβαση στα γαμετικά/σωματικά κύτταρα του ανθρώπου Η ΓΘ Γαμετικών κυττάρων θεωρείται ότι Έχει υπερβολική επιστημονική αβεβαιότητα ως προς τα μακροχρόνια αποτελέσματα Δημιουργεί το πειρασμό αλλαγής «κοινωνικών» χαρακτηριστικών Αφορά έρευνα σε έμβρυα- που δεν είναι δυνατόν να δώσουν συγκατάθεση 4. Αφορά στην αλλαγή γενετικού υλικού μελλοντικών ανθρώπων χωρίς την συγκατάθεση τους 5. Αφορά παρέμβαση στη γονιδιακή δεξαμενή του Ανθρώπου με απρόβλεπτες συνέπειες.

Είναι αποδεκτή η επέμβαση στα γαμετικά/σωματικά κύτταρα του ανθρώπου; Κοινωνικοί, επιστημονικοί , θρησκευτικοί και ιατρικοί φορείς συμφωνούν κατ’αρχήν στο ότι η ΓΘ σωματικών κυττάρων είναι αποδεκτή

RNA interference (RNAi) Κυτταρικός μηχανισμός όπου καταστέλλει την γονιδιακή έκφραση στο επίπεδο της μετάφρασης O Fire και συνεργάτες περιέγραψαν για πρώτη φορά την δράση του RNA interference (RNAi) σε ζωικά κύτταρα (Caenorhabditis elegans) Φυσικός ρόλος του RNAi Μηχανισμός άμυνας των κυττάρων, πολλών οργανισμών, κατά των ιών εισβολέων τους Μηχανισμός ρύθμισης της ενδογενούς γονιδιακής έκφρασης στο στάδιο της μετάφρασης

Γονιδιακή έκφραση και ρύθμιση Τι εννοούμε με τον όρο γονιδιακή έκφραση Είναι η αποκωδικοποίηση της πληροφορίας ενός γονιδίου για την κατασκευή μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης Η γονιδιακή έκφραση για την παραγωγή πρωτεϊνών πραγματοποιείται σε δύο στάδια: το στάδιο της μεταγραφής και το στάδιο της μετάφρασης

Γονιδιακή έκφραση και ρύθμιση Τι εννοούμε με τον όρο ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Είναι ο ποιοτικός και ποσοτικός έλεγχος που πραγματοποιείται με διάφορους μηχανισμούς από ένα κύτταρο Κάθε διαφοροποιημένο κύτταρο ενός συγκεκριμένου ιστού, μια δεδομένη χρονική στιγμή, έχει ανάγκη από την σωστή ποσότητα της κατάλληλης πρωτεΐνης για την εκτέλεση μιας καθορισμένης λειτουργίας Πρόδρομα ερυθρά αιμοσφαίρια παραγωγή αιμοσφαιρινών β-κύτταρα του παγκρέατος παραγωγή ινσουλίνη Κύτταρα τραυματισμένου ιστού παραγωγή μιτογόνων παραγόντων Κύτταρα μολυσμένα από ιό παραγωγή ιντερφερονών

RNA interference (RNAi) Σε σχέση με άλλες μεθόδους η συγκεκριμένη αποτελεί την πιο ειδική και την πιο αποτελεσματική για την καταστολή της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων που εμπλέκονται στην δημιουργία του καρκίνου όπως είναι τα ογκογονίδια Τύποι ογκογονιδίων Γονίδια που κωδικοποιούν αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους Γονίδια που εκφράζουν κυτταροπλασματικούς διαβιβαστές σημάτων Γονίδια που εκφράζουν μεταγραφικούς παράγοντες που ενεργοποιούν με την σειρά τους την έκφραση γονιδίων αυξητικών παραγόντων Γονίδια αντι-αποπτωτικών παραγόντων

RNA interference (RNAi) Μηχανισμός

RNA interference (RNAi) Created for Nature Reviews Genetics by Arkitek Studios Inc

RNA interference (RNAi) Εφαρμογές Routes Type of cancer Target gene i.p., i.v., s.c., i.t. Fibrosarcoma VEGF i.v. Pancreatic adenocarcinoma FAK, EphA2,RRM2 Breast cancer CXCR4, c-raf, i.p. Colon cancer β-Catenin Liver metastatic spleen cancer bcl-2 i.t. Bladder cancer PLK-1 Prostate cancer Raf-1, VEGF, EZH2, p110α Glioma EGFR, Cathepsin B Ovarian carcinoma HER2 Cervical adenocarcinoma HIF-1α, Rad51 Lung cancer Skp-2 Glioblastoma MMP-9, Cathepsin B Neuroblastoma VEGF-R2 i.t., i.v. Melanoma c-myc, MDM2, VEGF

RNA interference (RNAi) Το πρόβλημα λύθηκε με την χρήση τριών διαφορετικών φορέων Ιοί φορείς Λιποσωμάτια και Νανοσωματίδια Μη παθογόνα βακτήρια

RNA interference (RNAi) Ιοί φορείς Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Retrovirus υψηλή αποδοτικότητα ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του κυττάρου (μεταλλάξεις) Lentivirus μεταφορά μεγάλης ποσότητας πληροφοριών δεν έχει εύρος Adenovirus Δεν προκαλούν μεταλλάξεις ηπατοτοξικότητα Adeno-associated virus Όχι γνωστή παθογονικότητα Δεν χρησιμοποιούνται σε κύτταρα υπό διαίρεση Baculovirus Αβλαβής Περιορισμένα πειράματα μέχρι σήμερα

RNA interference (RNAi) Λιποσωμάτια και Νανοσωματίδια Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Λιποσωμάτια ευρεία χρήση Δεν παρουσιάζουν εξειδίκευση Νανοσωματίδια Καλοί φορείς για μεταφορά siRNA στους ιστούς των πνευμόνων Δύσκολα στην κατασκευή

RNA interference (RNAi) Λιποσωμάτια και Νανοσωματίδια

RNA interference (RNAi) Μη παθογόνα βακτήρια Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Μη παθογόνα βακτήρια Φθηνά, εύχρηστα, ελεγχόμενα με αντιβιοτικά Νέο σύστημα