Καθ Α. Μαυρίδου ΤΕΙ Αθήνας Mέθοδοι Καθ Α. Μαυρίδου ΤΕΙ Αθήνας

ISO 9308-1(2000) Detectiοn and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria Μέθοδος μεμβρανών Διήθηση 100 ml δείγματος Επώαση της μεμβράνης σε θρεπτικό υπόστρωμα Lactose TTC με sodium heptadecylsulfate (Tergitol) στους 36  2C/ 21  3 h. Παράλληλα μπορεί να γίνει επώαση ενός 2ου τρυβλίου στους 44 C (αύξηση εκλεκτικότητας). Καταμέτρηση των αποικιών που ζυμώνουν την λακτόζη προκαταρκτικά αποτελέσματα. Ανακαλλιέργεια των ύποπτων αποικιών σε TSA (τουλάχιστον 5-10) Δοκιμασία οξιδάσης (αρνητική)  κολοβακτηριειδή Δοκιμασία οξιδάσης (αρνητική) +δοκιμασία ινδόλης θετική (44  0.5C) Ε.coli

Nεότερες εξελίξεις ISO WG2 coliforms (24-25/1/2006) ISO 9308-1 Lactose TTC (tergitol) Αλλαγή ορισμών: Ολικά κολοβακτηριοειδή (coliforms): Enterobacteriaceae που παράγουν β-galactosidase Ε.coli: Enterobacteriaceae που παράγουν β-glucuronidase

E.coli Πειραματικά δεδομένα με μοριακές τεχνικές 2.5% δε είναι θερμοανθεκτικές 3.9% δεν παράγουν ινδόλη 8% δεν ζυμώνουν την λακτόζη 99.9% παράγουν β-glucuronidase Πολλά στελέχη Klebsiella toxitoca μοιάζουν με E.coli Προοπτικές Εκδοση συμπληρώματος 9308-1 με μία δοκιμασία ελέγχου παραγωγής β-glucuronidase Αλλαγή του προτύπου

ISO 7899-2 Detection and enumeration fo intestinal enterococci Μέθοδος μεμβρανών Διήθηση 100 ml δείγματος Επώαση σε Slanetz and Bartley (περιέχει sodium azide) στους 36  2C για 44  4 h. Μεταφορά της μεμβράνης σε τρυβλίο με θρεπτικό υπόστρωμα bile-aesculin-azide agar και επώαση τους 44  0.5C για 2h. Kαταμέτρηση όλωντων αποικιών που εμφανίζουν ένα μαύρο περιμετρικό χρώμα, δηλαδή που υδρολύουν την εσκουλίνη. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

ISO 12780 (2002) Enumeration of Pseudomonas aeruginosa Διήθηση 100 ml δείγματος Eπώαση σε Pseudomonas agar base+ CN supplement (cetrimide) στους 36  2C για 44  4 h. Αφού γίνει ανακαλλιέργεια 5-10 αποικιών σε TSA, ακολουθούν βιοχημικές δοκιμασίες ανάλογα με την μορφή των αποικιών: Α) Φθορισμός (θετικός) Β) δοκιμασία οξειδάσης (θετική) Γ)φθορισμός σε Κings’ medium Δ) παραγωγή αμμωνίας από acetamide broth μετά από προσθήκη αντιδραστηρίου Nessler (αλλαγή χρώματος σε κίτρινο έως καφεκόκκινο).

ISO 12780 (2002) Enumeration of Pseudomonas aeruginosa (συνέχεια) Χρώμα αποικίας Αμμωνία acatamide οξιδάση King’s Ps.aeru ginosa Πρασινο-μπλέ Δεν γίνεται θετική Φθορισμός + Κοκκινο-καφέ - Άλλες μορφές αρνητική

ISO 6461-2 92002) enumeration of Clostridium perfringens Mέθοδος διήθησης Διήθηση 100 ml δείγματος Επώαση σε θρεπτικό υπόστρωμα tryptone-Sulfite Cycloserine (TSC) και επώαση υπό αναερόβιες συνθήκες στους 44  0.5C για 24 και 48h. Η εκλεκτικότητα βελτιώνεται αν προστεθεί ένα ΄λεπτό στρώμα βασικού υλικού (χωρίς TSC) πάνω από την μεμβράνη. Καταμέτρηση τνω προκαταρκτικά θετικών αποικιών (γκρί- μαύρες). Ανακαλλιέργεια 5-10 αποικιών σε Nutrient agar και επώαση αερόβια και αναερόβια Αποδοχή των αποικιών που αναπτύσσονται αναερόβια. Βιοχημικές δοκιμασίες

ISO 6461-2 (2002) (συνέχεια) Βιοχημικές δοκιμασίες Γίνεται αφού αφαιρεθεί ο αέρας από τα υλικά σε bain-marιe για 15min και γρήγορη ψύξη. Buffered motility- nitrate medium Α)Eλεγχος για κινητικότητα: Νύξη του υλικού, επώαση αναεροβίως στους 36  2C για 24h και ανάπτυξη κατά μήκος της νύξης. Β)Αναγωγή των νιτρικών σε νιτρώδη: παρουσία κόκκινου χρώματος με προσθήκη nitrate reagents Lactose zelatine medium Επώαση αναεροβίως στους 36  2C για 24h Α) παραγωγή οξέος από λακτόζη. Β) Υγροποίηση της ζελατίνης:Τοποθετούμε τα σωληνάκια στο ψυγείο για 1-2h και παρατηρούμε τηνυγροποίηση.