Σύνθεση υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου και επισήμανσή τους με γάλλιο-68: μελέτη των φυσικών ιδιοτήτων τους και της βιοκατανομής τους σε πειραματόζωα Μ. Καραγεώργου Επιβλέποντες: Π. Μπουζιώτη, Δ. Σταμόπουλος Τριμελής Επιτροπή: Μ. Καλαμιώτου, Π. Μπουζιώτη, O. Tillememt Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Τα ραδιοεπισημασμένα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου ώς ιχνηθέτες διπλής απεικονιστικής ικανότητας συνδυάζουν δύο διαφορετικές απεικονιστικές μεθόδους (PET και ΜRI) παρέχοντας ταυτόχρονα φυσιολογικές και ανατομικές πληροφορίες. Για το λόγο αυτό αποτελούν ένα σημαντικό εργαλείο σε διαγνωστικές εφαρμογές. Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Truillet C. et al., Contrast Media and Molecular Imaging, 2014.

Τα νανοσωματίδια (nanoparticles-Nps) έχουν μέγεθος που κυμαίνεται από 1-100nm και φυσικά χαρακτηριστικά που τα καθιστούν κατάλληλα για χρήση ως ιχνηθέτες στην μοριακή απεικόνιση: μικρό μέγεθος: -συγκρίσιμο με βιομόρια στο εσωτερικό και στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, με αποτέλεσμα τη μεταξύ τους αλληλεπίδραση και συσσώρευση των νανοσωματιδίων στα καρκινικά κύτταρα -καθορίζει τον χρόνο παραμονής των νανοσωματιδίων στην κυκλοφορία του αίματος (Nps>200nm υφίστανται φαγοκυττάρωση, Nps<10nm υπόκεινται σε νεφρική απέκριση) μεγάλο λόγο επιφανείας πρός όγκο: -η μεγάλη τους επιφάνεια επιτρέπει τη σύζευξη μεγάλου αριθμού μορίων στόχευσης (αντισώματα, πεπτίδια, πρωτεϊνες) και ραδιοϊσοτόπων, με στόχο την ενεργητική στόχευση και διάγνωση των καρκινικών κυττάρων Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Μαγνητικές ιδιότητες Όσο μειώνεται το μέγεθος, η θερμική ενέργεια k B T > KV της ενέργειας μαγνητικής ανισοτροπίας, υπερπαραμαγνητική κατάσταση Μηδενικό συνεκτικό πεδίο και μηδενική παραμένουσα μαγνήτιση απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, έντονη μαγνητική επιδεκτικότητα παρουσία πεδίου Τ Β θερμοκρασία εγκλείδωσης (blocking), όπου k B T = KV, Τ Β = KV/ k B ln (τ m /τ 0 ) Για Τ Τ Β υπερπαραμαγνητική κατάσταση Όσο μειώνεται το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται και η θερμοκρασία εγκλείδωσης In vivo εφαρμογές: μαγνητική υπερθερμία, MRI απεικόνιση, στοχευμένη θεραπεία Liu et al., Current Opinion in Chemical Engineering, 2014, No. 4, Kolhatkar et al., Int. J. Mol. Sci., 2013, No. 14, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Ραδιοϊσότοπα Τα ασταθή ισότοπα που διασπώνται σε άλλα ισότοπα σταθερά ή ασταθή και εκπέμπουν ακτινοβολία που προκαλεί ιονισμό στην ύλη Ενεργότητα: dN/dt=-λΝ (1Ci=3.7 x Bq) Χρήση των ραδιοϊσοτόπων στην Πυρηνική Ιατρική για διαγνωστικούς ή θεραπευτικούς σκοπούς 68 Ga χρησιμοποιείται ώς ιχνηθέτης για απεικόνιση με Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίων (PET): Υψηλό ποσοστό εκπομπής β + (89%): p→ n+β + +ν e Εκλούεται από γεννήτρια 68 Ge/ 68 Ga Μικρός χρόνος υποδιπλασιασμού (t 1/2 =68min) 68 Ge t 1/2 = 271 d p + β - → n+ν e 68 Ga  + (1.9 ΜeV) t 1/2 = 68 min 68 Zn Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Γεννήτρια 68Ge/68Ga Έκλουση γεννήτριας με διάλυμα 0,1Μ HCl Διάλυμα Ν1: 80% Ακετόνη, 0.15Μ HCl Διάλυμα Ν2: 97.56% Ακετόνη, 0.1Μ HCl Τρείς εκλούσεις την ημέρα Στήλη Ανταλλαγής κατιόντων Έκλουση γεννήτριας Διάλυμα Ν1 Έκλουση 68 Ga Διάλυμα Ν2 Απομάκρυνση 68 Ge Καθαρό 68 Ga Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Σύνθεση Fe3O4 Nps και επισήμανσή τους με το ραδιοϊσότοπο 68-Ga Μελέτη των μορφολογικών και φυσικών ιδιοτήτων των Νps με XRD, DLS, AFM, SQUID In vitro μελέτη σταθερότητας In vivo αξιολόγηση σε πειραματόζωα και ex vivo μελέτη βιοκατανομής Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Σύνθεση SPIONs με τη μέθοδο συγκαταβύθισης: 0,25gr FeCl 2 ·4H 2 O και 0,20gr FeCl 3 διαλύθηκαν σε 10ml απιονισμένο H 2 O το οποίο βρισκόταν υπό μαγνητική ανάδευση (1500rpm) σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστέθηκαν απότομα 10ml NaOH (5,5M) και το μίγμα αμέσως μετατράπηκε σε σκούρο καφέ χρώμα από ανοιχτό πορτοκαλί που ήταν πρίν την προσθήκη της βάσης. Τα νανοσωματίδια διαχωρίστηκαν από το υπερκείμενο μέσω μαγνήτη. Ακολούθησαν πλύσεις των νανοσωματιδίων με H 2 O (τελικό pH=7). Περιθλασίγραμμα ακτίνων-Χ μαγνητίτη (Fe 3 O 4 ) Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Επισήμανση Fe 3 O 4 με 68 Ga: 250μL Nps, 550μl ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου (pH 4) και 200μl 68 Ga (46,2 ΜBq) επωάστηκαν σε 50°C για 30min. Η απόδοση της επισήμανσης προσδιορίστηκε μέσω χρωματογραφικής ανάλυσης χρησιμοποιώντας ταχεία χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και κιτρικό οξύ 0,1Μ ως κινητή φάση και βρέθηκε ίση με 97,2%. Έλεγχος σταθερότητας 68 Ga-Fe 3 O 4 με το χρόνο: Αξιολογήθηκε η σταθερότητα των 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps με το χρόνο και βρέθηκε ίση με 92% 30min, 97,6% 60min και 97,1% 120min μετά την επισήμανση χρησιμοποιώντας ταχεία χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και κιτρικό οξύ 0,1Μ ως κινητή φάση. In vitro έλεγχος σταθερότητας 68 Ga-Fe 3 O 4 σε φυσιολογικό ορό: 300μl 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps αναμείχθηκαν και επωάστηκαν με 1200μl φυσιολογικού ορού σε αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ο έλεγχος σταθερότητας πραγματοποιήθηκε 30min μετά την επώαση χρησιμοποιώντας ταχεία χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και κιτρικό οξύ 0,1Μ ως κινητή φάση και βρέθηκε ίσος με 95,4%. Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

R h =66nm για Fe 3 O 4 Nps R h =83nm για 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps k B T  R h = 6πηD  Γ=D*q 2 4πnsin(45 0 )  q= λ Μέτρηση υδροδυναμικής ακτίνας υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου με Δυναμική Σκέδαση Φωτός (DLS) Lim et al., Nanoscale Research Letters, 2013, 8:381 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

μm μm Προσαρτημένο chip πυριτίου σε βραχίονα με μια υπεραιχμηρή ακίδα 5-15 nm στο κάτω μέρος Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (AFM) Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Παρατήρηση μορφολογικών χαρακτηριστικών υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου με Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (AFM) Μορφολογικά χαρακτηριστικά των Fe 3 O 4 νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Μορφολογικά χαρακτηριστικά των ραδιοεπισημασμένων 68 Ga-Fe 3 O 4 νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου

Μαγνητικές ιδιότητες υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου Σε Τ=300Κ, η καμπύλη M(H) εμφανίζει μηδενικό Hc, υποδεικνύοντας υπερπαραμαγνητικά Fe 3 O 4 Nps. Mαγνήτιση κόρου Ms=43 emu/g (Τ=300Κ) και Ms= 52emu/g (Τ=10Κ). Θερμοκρασία blocking Τ Β = 175Κ. Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Τ Β =KV/ k B ln (τ m /τ 0 )

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Σε Τ=300Κ, η καμπύλη M(H) εμφανίζει μηδενικό Hc, υποδεικνύοντας υπερπαραμαγνητικά 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps. Mαγνήτιση κόρου Ms=32 emu/g (Τ=300Κ) και Ms= 39emu/g (Τ=10Κ). Θερμοκρασία blocking Τ Β = 163Κ. Τ Β =KV/ k B ln (τ m /τ 0 )

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Φυγοκέντρηση Fe 3 O 4 Nps για 2min υπό διαφορετική επιτάχυνση g (g=100m/s 2, g=200m/s 2 ). Προετοιμασία δείγματος σε γυάλινα πλακίδια ακολουθώντας ενα ειδικό πρωτόκολλο. Παρατήρηση των δειγμάτων στο Οπτικό Μικροσκόπιο (αντικειμενικός φακός 10x). Test 1: δείγμα χωρίς φυγοκέντρηση. Φυγοκέντρηση 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps με επιτάχυνση g=120m/s 2 σε διαφορετικούς χρόνους 30sec, 1min, 2min. Προετοιμασία δείγματος σε γυάλινα πλακίδια ακολουθώντας ενα ειδικό πρωτόκολλο. Παρατήρηση των δειγμάτων στο Οπτικό Μικροσκόπιο (αντικειμενικός φακός 10x). Γυάλινο πλακίδιο 1: δείγμα χωρίς φυγοκέντρηση, γυάλινο πλακίδιο 2: 1min φυγοκέντρηση.

Ex vivo βιοκατανομή H βιοκατανομή πραγματοποιήθηκε με ενδοφλέβια χορήγηση 0,1ml εναιωρήματος 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps σε 9 υγιή ποντίκια μέσω ουραίας φλέβας σε τρείς επιλεγμένους χρόνους. Τρείς ομάδες ποντικιών (3 σε κάθε χρονικό σημείο) θυσιάστηκαν και δείγματα αίματος και ιστών αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Yπολογίστηκε το ποσοστό κατακράτησης σε κάθε ιστό ώς % χορηγούμενη δόση/gr (%ID/g). Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Χορήγηση δείγματος σε πειραματόζωο τοποθετημένο σε κατάλληλη βάση. Μετρητής ακτινοβολίας γ πολλαπλών δειγμάτων Καρτέλα τοποθέτησης δειγμάτων

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Αποτελέσματα βιοκατανομής σε υγιή ποντίκια τα οποία θυσιάστηκαν 30min, 60min και 120min μετά τη χορήγηση με 68 Ga-Fe 3 O 4 Nps. Αποτελέσματα βιοκατανομής σε υγιή ποντίκια τα οποία θυσιάστηκαν 30min, 60min και 120min μετά τη χορήγηση με 68 Ga-acetate.

Μεγαλύτερος χρόνος παραμονής στο αίμα (υδροδυναμικό μέγεθος=30nm) Μικρότερο ποσοστό χορηγούμενης δόσης ανά γραμμάριο σε συκώτι και σπλήνα (υδροδυναμικό μέγεθος=30nm, βιοσυμβατή επικάλυψη με φωσφονική ένωση) Σύνθεση και χαρακτηρισμός πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο ραδιοϊσοτόπων του Ινστιτούτου Πυρηνικών Ερευνών “Vinča”, Βελιγράδι, Σερβία. Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου Ήπαρ Καρδιά Νεφρά Στομάχι Έντερα Σπλήνα Μύες Πνεύμονες Οστά Πάγκρεας Αίμα

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών “Δημόκριτος” Μαρία Καραγεώργου ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: 1.Υψηλής απόδοσης επισήμανση των υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου με το ραδιοϊσότοπο 68 Ga. 2.Το μέγεθος των υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου καθορίζει την χρήση τους σε in vivo εφαρμογές. 3.Μεγάλο ποσοστό χορηγούμενης δόσης ανά γραμμάριο σε συκώτι και σπλήνα, απορρόφηση νανοσωματιδίων από φαγοκύτταρα των ιστών αυτών, έλλειψη επικάλυψης με οργανική ή ανόργανη ένωση. 4.Τα ραδιοεπισημασμένα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου 68 Ga-Fe 3 O 4 παρουσίασαν μεγαλύτερη υδροδυναμική ακτίνα, μεγαλύτερα μορφολογικά χαρακτηριστικά και μικρότερες τιμές κατά την μέτρηση των μαγνητικών τους ιδιοτήτων. ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ: 1.Σύνθεση μικρότερου μεγέθους υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου. 2.Επιφανειακή τροποποίησή τους με βιοσυμβατή ένωση, ώστε να επιτευχθεί η επισήμανσή τους με το ραδιοϊσότοπο 68 Ga και η σύζευξή τους με βιομόρια στόχευσης, με στόχο την ενεργητική στόχευση καρκινικών κυττάρων. 3.Χρήση τους ως ιχνηθέτες διπλής απεικονιστικής (PET/MRI) ικανότητας σε πειραματόζωα.

Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας