ΙΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΧΡΩΣΗ ΗΩΣΙΝΗΣ-ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ Θεοδώρου Χάρις – Β15943 Επιβλέπων: Μπαλάσκας Χρήστος, Επίκουρος Καθηγητής Εργαστήριο Ανατομίας και Φυσιολογίας Αγροτικών Ζώων, Τμήμα Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής και Υδατοκαλλιεργειών, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΚΑΙ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΙΣΤΟTEMAXIΩΝ Ζωικό υλικό: χοίρος 90 ημερών. Ιστοτεμάχια από: Δωδεκαδάκτυλο. Νηστιδικά λεμφογάγγλια. Σπλήνα. Μονιμοποίηση ιστοτεμαχίων: τοποθέτηση σε διάλυμα 4% παραφορμαλδεΰδης σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 Μ pH 7,4 για 1 h και στη συνέχεια 2Χ30 min σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 Μ pH 7,4 για να εκπλυθεί ο μονιμοποιητικός παράγοντας. Αποθήκευση ιστοτεμαχίων: τοποθέτηση σε διάλυμα σακχαρόζης 7% και 0,1% NaN 3 σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 7,4 σε 4 0 C. 2

Ο ΑΠΑΓΩΓΟΣ (1), ΤΑ ΔΟΧΕΙΑ ΧΡΩΣΕΩΣ A DAMS (2) KAI ΙΣΤΟΧΗΜΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ, ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΚΑΙ ΑΝΑΔΕΥΤΗΡΑΣ (3)

ΤΟΜΕΣ ΚΡΥΟΤΟΜΟΥ Τοποθέτηση τμήματος του ιστοτεμαχίου, με τον απαιτούμενο κάθε φορά προσανατολισμό, σε τεμάχιο φελλού (διαστάσεων περίπου 1 x 1 cm) και κάλυψη με κρυοπροστατευτικό μέσο (Tissue-Tek). Ακολουθεί εμβάπτιση σε διάλυμα ισοπεντανίου, που είχε ήδη τοποθετηθεί σε υγρό άζωτο, που λειτουργεί ως κρυοπροστατευτικός παράγοντας απέναντι στην εμβάπτιση στο υγρό άζωτο. Στη συνέχεια, τοποθέτηση του ιστοτεμαχίου με το φορέα–φελλό σε ειδική υποδοχή του κρυοτόμου, στην οποία είχε προηγουμένως προστεθεί κρυοπροστατευτικό μέσο, επικαλυπτόμενο εκ νέου και συνολικά με κρυοπροστατευτικό μέσο. Παραλαβή τομών του ιστοτεμαχίου με πάχος 10 μm, σε αντικειμενοφόρες πλάκες, επικαλυμμένες με πολυμερισμένη L-λυσίνη, και στη συνέχεια αποθήκευση στους 4  C. 4

Ο ΚΡΥΟΤΟΜΟΣ, Ο ΠΑΓΚΟΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ Ο ΑΠΑΓΩΓΟΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ 5

Ι ΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΧΡΩΣΗ Με λίγες εξαιρέσεις οι περισσότεροι ιστοί είναι άχρωµοι, γεγονός που δυσκολεύει την παρατήρησή τους στο µικροσκόπιο. Γι’ αυτό το λόγο έχουν αναπτυχθεί τεχνικές για τη χρώση των ιστών, που επιτρέπουν τόσο τη παρατήρηση των επιµέρους συστατικών του ιστού, αλλά και τη διάκριση ανάµεσα τους. Αυτό επιτυγχάνεται µε τη χρήση µιγµάτων χρωστικών που έχουν τη τάση να χρωµατίζουν τα στοιχεία του ιστού περισσότερο ή λιγότερο εκλεκτικά. Οι περισσότερες χρωστικές συµπεριφέρονται σαν βασικές ή όξινες ενώσεις, και έχουν τη τάση να σχηµατίζουν άλατα µε τις ιονίζουσες ρίζες των ιστών. Από όλες τις χρωστικές, ο συνδυασµός της αιµατοξυλίνης και ηωσίνης είναι αυτός που χρησιµοποιείται πιο συχνά. 6

Ι ΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΧΡΩΣΗ ΗΩΣΙΝΗΣ – ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ 7 Η διήθηση σε χαρτί των χρωστικών είναι επιβεβλημένη πριν από κάθε χρήση. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες με τις τομές προς χρώση μένουν για περίπου 1 min σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια εμβαπτίζονται σε Adams rack σε PBS 0,1 Μ και pH 7,4 για 3 min. Αρχικά οι αντικειμενοφόρες πλάκες εμβαπτίζονται και παραμένουν στην αιματοξυλίνη Harris για 2 min, με ανάδευση κάθε 10 περίπου sec. Ξεπλένονται με νερό βρύσης και αμέσως μετά εμβαπτίζονται στην ηωσίνη για επίσης 2 min, με την ίδια περιοδικότητα στην ανάδευση. Ακολούθησε και πάλι ξέπλυμα των αντικειμενοφόρων πλακών με νερό βρύσης, αυτή τη φορά μικρότερης διάρκειας και έντασης για να επιτευχθεί πιο ζωηρό πορτοκαλί χρώμα κατά τη χρώση των τομών. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετήθηκαν σε υδατικά διαλύματα αιθυλικής αλκοόλης ανιούσας σειράς (2 x 50%, 70%, 90%, 2 x 100%) και τελικά 2 x ξυλένιο, έτσι ώστε να επιτευχθεί η αφυδάτωση των τομών. Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόρες πλάκες παρέμειναν στον απαγωγό για να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου και τελικώς επικαλύφθηκαν με DepeΧ και καλυπτρίδες. Η παρατήρηση και φωτογράφηση των χρώσεων πραγματοποιήθηκε σε οπτικό μικροσκόπιο, χρησιμοποιώντας λογισμικό για ανάλυση εικόνας (Image-Pro Plus). Η αιματοξυλίνη Harris βάφει τους πυρήνες των κυττάρων με μπλε χρώμα, ενώ η ηωσίνη βάφει το κυτταρόπλασμα των κυττάρων με πορτοκαλί έως ροδόχροο χρώμα.

ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΩΝ ΧΡΩΣΜΕΝΩΝ ΤΟΜΩΝ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ 8

ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑΠΟ ΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ

10 Δωδεκαδάκτυλο χοίρου. Χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης. Διακρίνονται ο αυλός του εντέρου (αστερίσκος) και οι εντερικές λάχνες (Χ). * x

11 Δωδεκαδάκτυλο χοίρου. Χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης. Διακρίνονται στην υποβλεννογόνιο στοιβάδα αιμοφόρα αγγεία, φλέβα (Χ) και αρτηρία (*). * x x

12 Δωδεκαδάκτυλο χοίρου. Χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης. Διακρίνεται ο βλεννογόνος με επιμήκεις λάχνες (Χ) και χαρακτηριστικά καλυκοειδή κύτταρα (*). x * *

13 Νηστιδικό λεμφογάγγλιο χοίρου. Χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης. Διακρίνονται χαρακτηριστικά λεμφοκύτταρα (Ο). Ο

14 Σπλήνας χοίρου. Χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης. Διακρίνονται η ινώδης κάψα του σπλήνα (Χ), ινώδεις δοκίδες που διεισδύουν στο παρέγχυμα (*) και ο ερυθρός πολφός (π). Χ * π

15 Σπλήνας χοίρου. Χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης. Διακρίνονται σπληνικό σωμάτιο (Χ) περιχαρακωμένο από τριχοειδή αγγεία (*). Χ * * * * * * * * * * * * * * * *

Τ ΕΛΟΣ Ευχαριστώ για το χρόνο σας!!! 16