1 ΑΝΟΣΟΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΩΓΙΑΤΗΣ ΓΙΩΡΓΟΣ Β15985 Ε.Ζ.Π κ Υ

2 Ανοσοδιαγνωστικές Μέθοδοι Είναι μέθοδοι προσδιορισμού της συγκέντρωσης ουσιών σε βιολογικά υγρά που στηρίζονται στον ανταγωνισμό μεταξύ ενός ιχνηθετημένου (Ag*) και μη αντιγόνου (Ag) για την κάλυψη των ίδιων συνδετικών θέσεων στο μόριο του αντισώματος(Ab). Ο ιχνηθέτης μπορεί να είναι ραδιοισότοπο (ραδιοανοσολογικές μέθοδοι,RIA) ή ένζυμο (ανοσοενζυματικές μέθοδοι,ELISA).

3 Προυποθέσεις ανάπτυξης ανοσοδιαγνωστικών μεθόδων: 1.Καθαρό αντιγόνο για την παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων 2.Κατάλληλα σημασμένο, ιχνηθετημένο αντιγόνο 3.Αντίσωμα υψηλης συγγένειας και ειδικότητας 4.Αποτελεσματική μέθοδος διαχωρισμού των σχηματιζόμενων ανοσοσυμπλεγμάτων και μέτρηση της ραδιενέργειας(RIA) ή της οπτικής απορρόφησης(ELISA).

4 RIA Στις μεθόδους RIA (ραδιοανοσολογικές - Radio Immuno Assays) μετράται η εκπεμπόμενη ραδιενέργεια (β ή γ ακτινοβολία) από τα ραδιοισότοπα. Τα πλέον χρησιµοποιούµενα ραδιοισότοπα είναι το ιώδιο(Ι-125 & Ι-131), το τρίτιο (Η3), ο άνθρακας (C-14).

5 Συναγωνιστική RIA για μέτρηση αντιγόνου Το σημασμένο αντιγόνο συναγωνίζεται με το ψυχρό (δείγμα) για την κατάληψη των ίδιων συνδετικών θέσεων στο μόριο του αντισώματος. Με προσθήκη δεύτερου αντισώματος και φυγοκέντρηση γίνεται διαχωρισμός των δεσμευμένων αντιγόνων. Ακολουθεί μέτρηση της ραδιενέργειας και κατασκευή πρότυπης καμπύλης +  Prior to Test Σημασμένο Ag +  Test + Δείγμα Σημασμένο Ag +

6 Μη συναγωνιστική RIA στερεής φάσης Προσδιορισμός Ag –Προσρόφηση Ab –Επώαση με δείγμα –Προσθήκη σημασμένου αντισώματος –Μέτρηση ραδιενέργειας και κατασκευή πρότυπης καμπύλης –Η ποσότητα του συνδεδεμένου ανάλογη της συγκέντρωσης στο δείγμα Σταθερή φάση Ag Προσρόφηση Ag στο δείγμαi Σημασμένο Ab

7 Μη συναγωνιστική RIA Προσδιορισμός Ab de –Προσρόφηση Ag –Επώαση με δείγμα –Προσθήκη σημασμένου anti- IGg –Η ποσότητα του συνδεδεμένου ανάλογη με τη συγκέντρωση του Ab στο δείγμα Solid Phase Ag Προσρόφηση Ab στο δείγμα Σημασμένο Anti-Ig

8 Μετρητής γ ακτινοβολίας

9 ELISA Για την µέθοδο ΕLISΑ(ενζυµοανοσολογική, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) χρησιμοποιούμε ως ιχνηθέτη ένα ένζυμο που με την προσθήκη υποστρώματος μπορεί να αναπτύξει χρώμα. Το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο ένζυμο είναι η υπεροξειδάση της αγριοραπανίδας(horseradish peroxidase enzyme).

10 ELISA ΤΕΧΝΙΚΗ Τα βασικά βήµατα της είναι: Α. το αντίσωµα Ab αντιδρά µε το αντιγόνο Αg και με το επισημασμένο αντιγόνο Ag*. Ag + Ag* + Ab ↔ AgAb + Ag*Ab. Β. γίνεται διαχωρισμός των ελεύθερων αντιγόνων από τα δεσμευμένα. Γ. προστίθεται υπόστρωµα και παράγεται χρωµατική αντίδραση ∆. ακολουθεί µέτρηση της απορρόφησης φωτοµετρικά. Ε. υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις του αντιγόνου με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης

Πηγή: ELISA ΤΥΠΟΙ ELISA

Πηγή:

14 Συναγωνιστική ELISA, Βήματα Επώαση του δείγματος (αντιγόνο) με μια γνωστή (περίσσεια) ποσότητα αντισώματος όλο το αντιγόνο συνδέεται με το αντίσωμα (και παραμένει και ελεύθερο) Ξέπλυμα (παραμένει μόνο το συνδεδεμένο) Προσθήκη δευτέρου αντισώματος (συνδεδεμένου με ένζυμο) εναντίον του πρώτου Οσο περισσότερο αντιγόνο, τόσο λιγότερες θέσεις αντισώματος Όσο περισσότερο αντιγόνο, τόσο λιγότερο χρώμα

15 Sandwich ELISA, Βήματα Προσρόφηση αντισώματος Προσθήκη δείγματος (αντιγόνου) Προσθήκη δευτέρου αντισώματος, συνδεδεμένου με ένζυμο (συνδέεται σε διαφορετικό επίτοπο του πρώτου αντισώματος Όσο περισσότερο αντιγόνο, τόσο περισσότερο χρώμα

16 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΤΟ ΠΡΩΤΟΓΑΛΑ ΠΡΟΒΑΤΟΥ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ELISA Σκοπός του πειράματος ήταν ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των αντισωμάτων σε πρωτόγαλα υποσιτισμένων και μη προβατίνων και η ανεύρεση πιθανών διαφορών.

17 ΜΕΘΟΔΟΣ Παραλάβαμε KIT γνωστής εταιρείας (ALPHA DIAGNOSTIC INTERNATIOMAL) με το οποίο προσδιορίζεται ποσοτικά η συγκέντρωση των αντισωμάτων(IgG) στο πρωτόγαλα του προβάτου με τη μέθοδο της άμεσης ELISA.

18 ΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΟΥ ΠΡΩΤΟΓΑΛΑΚΤΟΣ

19 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ Αρχικά πραγματοποιούμε αραιώσεις. Αραιώνουμε το δείγμα πρωτογάλακτος σε ρυθμιστικό διάλυμα, κάνοντας 2 αραιώσεις με τελική 1/

20 1 ο Προετοιμασία Προσδιορίσαμε τον αριθμό των φρεατίων για τη λειτουργία της μεθόδου. Χρησιμοποιήθηκαν 2 φρεάτια για κάθε άγνωστο δείγμα και 2 για κάθε πρότυπο διάλυμα(STANDARD) Στη συνέχεια προσθέσαμε 300ul διάλυμα πλύσης σε κάθε φρεάτιο και τα αφήσαμε για περίπου 5 λεπτά πριν την προσθήκη του δείγματος Αναρροφήσαμε το υγρό από το κάθε φρεάτιο.

21 2 ο.1 η επώαση προσθέσαμε 100μl δειγμάτων και 100μl πρότυπων διαλυμάτων σε κάθε ένα από τα προκαθορισμένα φρεάτια. έγινε ανάμιξη των αντιδραστηρίων και επώαση για 60 λεπτά. Αναρροφήσαμε το υγρό από το κάθε φρεάτιο και τα πλύναμε 4 φορές.

22 3 ο. 2 η επώαση προσθέσαμε 100 μl του Anti-sheep IgG-HRP Conjugate(δεύτερο αντίσωμα έναντι των IgG επισημασμένο με ένζυμο) σε κάθε φρεάτιο επωάσαμε για 30 λεπτά πλύναμε 5 φορές την πλάκα όπως στην επώαση 1

23 4 ο. επώαση του υποστρώματος Προσθέσαμε 100μλ TMB Substrate (υπόστρωμα του ενζύμου) σε κάθε φρεάτιο. Το υγρό σε κάθε φρεάτιο άρχισε να γίνεται μπλέ. Επωάσαμε για 15 λεπτά στο σκοτάδι..

24 5 ο. Τερματισμός αντίδρασης προσθέσαμε σε κάθε φρεάτιο 100μλ από το Stop Solution, η αντιδραση του ενζύμου σταμάτησε και το υγρό σε κάθε πηγαδάκι έγινε κίτρινο.

25 6 ο. ανάγνωση της απορρόφησης για την μέτρηση της απορρόφησης χρησιμοποιήσαμε ένα ειδικό φωτόμετρο για ELISA σε μήκος κύματος 450 nm. διαβάσαμε την απορρόφηση των φρεατίων της πλάκας στα 450nm.

26 Υπολογισμοί αποτελεσμάτων τα αποτελέσματα υπολογίστηκαν με την αποτύπωση των δεδομένων σε ημιλογαριθμικό χαρτί με σχεδιασμό της καμπύλης πρότυπων διαλυμάτων.