Ασκήσεις Ανοσολογίας Π.Παπαζαφείρη Α. Μαρμάρη ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ Εισαγωγή MTT TNFα Πειραματική διαδικασία Υπολογισμοί

Κυτταροτοξικότητα Η ιδιότητα θανάτωσης κυττάρων είτε από κάποια χημική ουσία (φαρμακευτικές ουσίες, τρόφιμα, καλλυντικά) είτε από κάποιο κύτταρο (π.χ. κυτταροτοξικό Τ κύτταρο). Σε αντίθεση με τη νέκρωση και την απόπτωση, ο όρος κυτταροτοξικότητα δεν προσδιορίζει συγκεκριμένο μηχανισμό κυτταρικού θανάτου.

ΜΤΤ [ 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ] ή ΧΤΤ [ 2H-Tetrazolium, 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5- [(phenylamino)carbonyl]-hydroxide ] –στηρίζεται στο ότι τα νεκρά κύτταρα δε μπορούν να μεταβολίσουν διάφορα άλατα τετραζολίου. Tr ypan blue, χρώση νεκρών κυττάρων Ιώδες Γεντειανής, χρώση πρωτεϊνών διαρροή μεμβράνης --  LDH –στηρίζεται στο ότι η διαφοροποίηση της κυτταρικής μεμβράνης οδηγεί σε διαρροή συστατικών στο υπερκείμενο υγρό. Τρόποι εκτίμησης Κυτταροτοξικότητας

MTT or XTT αρχή μεθόδου: τα ζωντανά κύτταρα μπορούν να ανάγουν άλατα τετραζολίου (ΜΤΤ ή ΧΤΤ) σε χρωματιστά σύμπλοκα φορμαζάνης ενώ τα νεκρά κύτταρα δεν μπορούν. Αφού ένας κυτταροτοξικός παράγοντας μειώνει την αναγωγή των αλάτων τετραζολίου η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για να μετρήσει είτε κυτταροτοξικότητα που επάγεται από τον συγκεκριμένο παράγοντα είτε γενικότερα νέκρωση.

ΜΤΤ [3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]

ΜΤΤ Σε πιάτο ELISA καλλιεργούνται κύτταρα, παρουσία ή απουσία του κυτταροτοξικού παράγοντα (TNFα) τα οποία επωάζονται με ΜΤΤ για τις τελευταίες 4 ώρες. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, τα ζωντανά κύτταρα μπορούν να μετατρέψουν το ΜΤΤ σε φορμαζάνη. Μετρείται με χρωμομετρία η ποσότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου φορμαζάνης.

Κυτταροτοξικότητα TNFα Η καχεξίνη (Tumor Necrosis Factor α, TNFα) είναι μια κυτταροκίνη η οποία έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί κατά του καρκίνου. Ο TNFα παράγεται από μονοκύτταρα / μακροφάγα, Τ- λεμφοκύτταρα, ινοβλάστες, μαστοκύτταρα και λεία μυικά κύτταρα. Υποδοχείς του TNFα βρίσκονται σε πληθώρα κυττάρων, όπως ενεργοποιημένα Τ- και Β- λεμφοκύτταρα, ινοβλάστες, επιθηλιακά κύτταρα, φυσικά κυτταροτοξικά κύτταρα, ουδετερόφιλα, οστεοκλάστες, ηπατοκύτταρα, προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα και κύτταρα πολλών όγκων.

Η βιολογική δράση του TNFα: προάγει α) τον πολλαπλασιασμό των Τ- λεμφοκυττάρων και την έκφραση υποδοχέων της IL-2, β) τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β-λεμφοκυττάρων, γ) την κυτταρολυτική δράση των φυσικών κυτταροτοξικών κυττάρων, δ) την παραγωγή των IL-1, GM-CSF, G- CSF, PDGF, ε) την έκφραση αντιγόνων που κωδικοποιούνται από τα γονίδια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι, στ) την κυτταροτοξική δράση για ορισμένους όγκους, ζ) τη δράση των οστεοκλαστών και η) τη συσσώρευση των ουδετεροφίλων.

Διαφορές νέκρωσης και απόπτωσης αφορά ομάδες εφαπτόμενων κυττάρων προκαλείται από μη φυσιολογικές διαταραχές (λυτικούς ιούς, υποθερμία, ισχαιμία, δηλητήρια) φαγοκύτωση από μακροφάγα σημαντική αντίδραση φλεγμονής αφορά μεμονωμένα κύτταρα προκαλείται από φυσιολογικά ερεθίσματα (έλλειψη αυξητικών παραγόντων, αλλαγές στο ορμονικό περιβάλλον) φαγοκύτωση από μακροφάγα δεν υπάρχει αντίδραση φλεγμονής Φυσιολογική σημασία Νέκρωση Απόπτωση

Πειραματική διαδικασία Χρησιμοποιούμε: μονόστιβη καλλιέργεια L929 κυττάρων (κυτταρική σειρά ινοβλαστών προερχόμενη από υποδόριο αποθηκευτικό ιστό φυσιολογικού C34/An ποντικού με ιδιότητες προσκόλλησης σε πλαστική επιφάνεια φιάλης καλλιεργειών). Υπερκείμενο καλλιέργειας μακροφάγων που περιέχει TNFα, άγνωστης συγκέντρωσης. Πρότυπο διάλυμα TNFα με συγκέντρωση στο αρχικό διάλυμα 10μg/ml.

Αρχή της μεθόδου Τα κύτταρα που λύονται, αποκολλώνται από την πλαστική επιφάνεια, ενώ τα ζωντανά κύτταρα στο τέλος της δοκιμασίας χρωματίζονται με ιώδες της Γεντειανής (crystal violet). Η ποσότητα της χρωστικής ουσίας που απορροφάται, είναι ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων που παραμένουν προσκολλημένα στην πλαστική επιφάνεια και προσδιορίζεται ποσοτικά με φασματοφωτομετρία.

Τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας Σε πλάκα μικροτιτλοποίησης με επίπεδα φρεάτια, τοποθετούνται 100 λ εναιωρήματος L929 κυττάρων με συγκέντρωση 3 x 10 5 /ml σε θρεπτικό υλικό DMEM συμπληρωμένο με 5 % FCS. Τα φρεάτια της 1ης στήλης (Α1, Β1, C1 και D1) αφήνονται κενά προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως μάρτυρες. Η πλάκα επωάζεται για 24 ώρες σε ατμόσφαιρα CO 2, στους 37ο C. Με αναστροφή της πλάκας απομακρύνεται, από όλα τα φρεάτια, το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό και τοποθετoύνται εκ νέου 100 λ θρεπτικού υλικού το οποίο περιέχει επιπλέον 2 μg/ml εμετίνης. Στη θέση Α2, Β2 προσθέτονται 100 λ διαλύματος rhuTNFα,(πρότυπο διάλυμα,10μg/ml)) ενώ στις θέσεις C2 και D2 προσθέτονται 100 λ των δειγμάτων (υπερκείμενο μακροφάγων) και αναδεύονται ήπια.

TNFα Μακρο -φάγα Θρεπτικό υλικό κύτταρα Αραιώσεις 1:1 1:2 1:4……………………………………………..

Τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας Το περιεχόμενο των φρεατίων Α2, Β2, C2 και D2 αραιώνεται διαδοχικά με μεταφορά 100 λ υλικού στις επόμενες θέσεις αντίστοιχα. Ακολουθεί ήπια ανάδευση και οι αραιώσεις συνεχίζονται με τον ίδιο τρόπο μέχρι τις θέσεις Α11, Β11, C11 και D11. Στις θέσεις Α12, Β12, C12 και D12 έχουν τοποθετηθεί μόνον κύτταρα. Η πλάκα επωάζεται για 24 ώρες σε ατμόσφαιρα CO 2 στους 37ο C. Με αναστροφή της πλάκας απομακρύνεται, από όλα τα φρεάτια, το υπερκείμενο υγρό και τοποθετoύνται 100 λ μεθανόλης. Η πλάκα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά της ώρας, έτσι ώστε να γίνει η μονιμοποίηση των κυττάρων. Η πλάκα ξεπλένεται 3-4 φορές με τρεχούμενο νερό, σε κάθε φρεάτιο τοποθετoύνται 100 λ διαλύματος χρωστικής και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά της ώρας. Ακολουθεί καλό ξέπλυμα της πλάκας με τρεχούμενο νερό (απομάκρυνση της χρωστικής) και στέγνωμα. Τα χρωματισμένα κύτταρα παρατηρούνται σε μικροσκόπιο αντίθετης φάσης.

θέσηOD*αραίωσησυγκέντρωσηLn αραίωσηςκυτταροτοξικότητα OD*: πρέπει να υπολογιστεί από τον μέσο όρο και τους μάρτυρες θέσηOD*αραίωσηLn αραίωσηςκυτταροτοξικότητα OD*: πρέπει να υπολογιστεί από τον μέσο όρο και τους μάρτυρες Αποτελέσματα για το rTNFa Αποτελέσματα για το υπερκείμενο των μακροφάγων

Υπολογισμοί Εκτίμηση αποτελεσμάτων 100 λ διαλύματος παγόμορφου οξικού οξέος τοποθετούνται σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες αναδεύονται ήπια και η οπτική πυκνότητα υπολογίζεται με φίλτρο μήκους κύματος 540 nm σε φασματοφωτόμετρο πλακών μικροτιτλοποίησης. Η κυτταροτοξικότητα υπολογίζεται σε κάθε αραίωση του υπό εξέταση δείγματος σύμφωνα με την εξίσωση (%): όπου: (α) ο μέσος όρος οπτικής πυκνότητας των φρεατίων στα οποία έχει τοποθετηθεί μόνο θρεπτικό υλικό στα κύτταρα και (β) η οπτική πυκνότητα του υπό εξέταση δείγματος

TNFα Μακρο -φάγα Θρεπτικό υλικό κύτταρα Αραιώσεις 1:1 1:2 1:4…………………………………………….. β΄ Αρνητικός μάρτυρας α΄ α= α΄- αρνητικός μάρτυρας β= β΄- αρνητικός μάρτυρας

Υπολογισμοί Εκτίμηση αποτελεσμάτων Κατασκευάζεται ευθεία ελαχίστων τετραγώνων με συντεταγμένες (χ, ψ) τις αραιώσεις του rhuTNFα και τις αντίστοιχες τιμές οπτικής πυκνότητας. Σχεδιάζεται καμπύλη κυτταροτοξικότητας για τον rhuTNFα και το υπερκείμενο των μακροφάγων στο ίδιο γράφημα (προσοχή: διάκριση μεταξύ τους!) Υπολογίζεται η συγκέντρωση του rhuTNFα που προκαλεί 50% κυτταροτοξικότητα (έστω Αμg/ml) Υπολογίζεται η αραίωση του υπερκειμένου των μακροφάγων που προκαλεί 50% κυτταροτοξικότητα (έστω αραίωση 1/Χ) Στην αραίωση 1/Χ των μακροφάγων υπάρχει TNFα σε συγκέντρωση Αμg/ml. Να υπολογιστεί η συγκέντρωση στο μη αραιωμένο υπερκείμενο των μακροφάγων

γραφική παράσταση (Ι) με συντεταγμένες τις αραιώσεις του rTNFa και τις αντίστοιχες τιμές οπτικής πυκνότητας γραφική παράσταση (ΙΙ) με συντεταγμένες τις τιμές “- l n αραίωσης” και τις αντίστοιχες τιμές κυτταροτοξικότητας

Παραδείγματα συγκριτικής αποτύπωσης της βιωσιμότητας

ΜΤΤ, αποτελέσματα της μεθόδου

Ποια από τις μεθόδους (χρώσεις) είναι περισσότερο ακριβής, γιατί;