1 ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΑΣΚΗΣΗ ΠΡΑΞΗΣ 12η ΠΡΩΤΕΪΝΟΣΥΝΘΕΣΗ

2 ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ 14 Η ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΟΣΥΝΘΕΣΗΣ ΦΡΑΓΚΙΑΔΑΚΗΣ Γ.Α.

3 Η μετάφραση του mRNA, δηλαδή η αντιστοίχιση των κωδικίων σε αμινοξέα και η σύνδεση των αμινοξέων σε πολυπεπτιδική αλυσίδα, πραγματοποιείται στα ριβοσώματα με τη βοήθεια των tRNA, βοηθητικών πρωτεϊνών και ενέργειας. Τα ριβοσώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη μετάφραση mRNA άλλων οργανισμών και τα βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση ανθρώπινων πρωτεϊνών, όπως ινσουλίνης.

4

5 Διαφορές προκαρυωτικών – ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων

6 Κάθε ριβόσωμα αποτελείται από δύο υπομονάδες, μια μικρή και μια μεγάλη. Έχει μια θέση πρόσδεσης mRNA στη μικρή υπομονάδα και δύο θέσεις εισδοχής tRNA στη μεγάλη υπομονάδα. Κάθε tRNA έχει μια ειδική τριπλέτα νουκλεοτιδίων, το αντικωδίκιο με την οποία προσδένεται, λόγω συμπληρωματικότητας, με το αντίστοιχο κωδίκιο του mRNA. Επιπλέον, κάθε tRNA διαθέτει μια θέση σύνδεσης με ένα συγκεκριμένο αμινοξύ.

7

8 ΓΕΓΟΝΟΤΑ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ Οι ριβοσωμικές υπομονάδες αυτο-συναρμόζονται in vitro από τα μόρια (rRNA) που τις αποτελούν. Επάνω στο mRNA, και παρουσία «φορτισμένων» με αμινοξέα tRNAs, γίνεται η πρωτεϊνοσύνθεση: 1. Από το N-άκρο στο C-άκρο της πρωτεΐνης. 2. Τα ριβοσώματα «διαβάζουν» το mRNA στην κατεύθυνση 5' προς 3'. 3. Διαδοχική προσθήκη αμινοξέων στο C-άκρο, σε τρία στάδια, έναρξη - initiation, επιμήκυνση – elongation, τερματισμός - termination. Και τα τρία στάδια απαιτούν τη συμμετοχή ειδικών πρωτεϊνών.

9 Η πρωτεϊνοσύνθεση διακρίνεται σε τρία στάδια: την έναρξη, την επιμήκυνση και τη λήξη.

10 ΕΝΑΡΞΗ - INITIATION Η έναρξη της μετάφρασης σε προκαρυώτες και ευκαρυώτες απαιτεί ένα ειδικό εναρκτήριο tRNA, tRNA-met (φορμυλιωμένη σε προκαρυώτες) που προσφέρει την αρχική μεθειονίνη στις πρωτεΐνες. Η έναρξη της μετάφρασης απαιτεί αναγνώριση ενός κωδικίου AUG. Στα πολυκιστρονικά προκαρυωτικά RNAs το κωδίκιο AUG βρίσκεται παρά τη λεγόμενη αλληλουχία Shine-Delgarno, που αναγνωρίζεται από συμπληρωματικές αλληλουχίες στο rRNA (16S στην E. coli). Στους ευκαρυώτες τα εναρκτήρια AUGs περιβάλλονται από αλληλουχίες A/GCCA/GCCAUGA/G στα περισσότερα mRNAs.

11 Έναρξη Κατά την έναρξη της μετάφρασης το mRNA συνδέεται μέσω μιας αλληλουχίας που υπάρχει στην 5΄ αμετάφραστη περιοχή του, με το ριβοσωμικό RNA της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος, βάσει της συμπληρωματικότητας των βάσεων. Το πρώτο κωδίκιο του mRNA είναι πάντα AUG και σ’ αυτό προσδένεται tRNA που φέρει το αμινοξύ μεθειονίνη.

12 Έναρξη Βέβαια, δεν έχουν όλες οι πρωτεΐνες ως πρώτο αμινοξύ τη μεθειονίνη. Αυτό γιατί σε πολλές πρωτεΐνες μετά τη σύνθεσή τους απομακρύνονται αμινοξέα από το αμινικό άκρο τους. Το σύμπλοκο που δημιουργείται μετά την πρόσδεση του mRNA στη μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος και του tRNA που μεταφέρει μεθειονίνη ονομάζεται σύμπλοκο έναρξης. Μετά η μεγάλη υπομονάδα συνδέεται με τη μικρή.

13

14 ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΝΑΡΞΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥΣ Οι ειδικές πρωτεΐνες, που δεν είναι συνδεμένες με τα ριβοσώματα, αλλά είναι απαραίτητες για την επακριβή έναρξη της μετάφρασης, καλούνται παράγοντες έναρξης (initiation factors). Στην E. coli καλούνται IFs ενώ στα ευκαρυωτικά eIFs. Έχει βρεθεί ικανός αριθμός eIFs:

15

16

17

18 ΤΟ GTP ΚΑΙ ΟΙ eIF

19 Επιμήκυνση Κατά την επιμήκυνση ένα δεύτερο μόριο tRNA με αντικωδίκιο συμπληρωματικό του δεύτερου κωδικίου του mRNA τοποθετείται στην κατάλληλη εισδοχή του ριβοσώματος, μεταφέροντας το δεύτερο αμινοξύ. Μεταξύ μεθειονίνης και δεύτερου αμινοξέος σχηματίζεται πεπτιδικός δεσμός (δράση πεπτιδυλ- τρανσφεράσης). Στη συνέχεια, το πρώτο tRNA αποσυνδέεται από το ριβόσωμα και απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα.

20 Επιμήκυνση Το ριβόσωμα και το mRNA έχουν τώρα ένα tRNA, πάνω στο οποίο είναι προσδεδεμένα δύο αμινοξέα. Έτσι αρχίζει η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στη συνέχεια το ριβόσωμα κινείται κατά μήκος του mRNA κατά ένα κωδίκιο. Ένα τρίτο tRNA έρχεται να προσδεθεί μεταφέροντας το αμινοξύ του. Ανάμεσα στο δεύτερο και στο τρίτο αμινοξύ σχηματίζεται πεπτιδικός δεσμός. Το πολυπεπτίδιο συνεχίζει να επιμηκύνεται, καθώς νέα tRNA φέρουν αμινοξέα τα οποία προσδένονται μεταξύ τους.

21

22 ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ - Elongation H επιμήκυνση των πολυπεπτιδίων συμβαίνει με κυκλικό τρόπο, ώστε στο τέλος μιας πλήρους προσθήκης αμινοξέος το Α site θα είναι άδειο και έτοιμο να δεχθεί το εισερχόμενη αμινοάκυλο-tRNA που υπαγορεύεται από το επόμενο κωδικόνιο mRNA. Αυτό σημαίνει ότι το ριβόσωμα πρέπει να μετακινηθεί προς στο mRNA στο επόμενο κωδικόνιο. Κάθε εισερχόμενο αμινοάκυλο-tRNA φέρεται στο ριβόσωμα με το eEF-1α-GTP.

23 Η πορεία κάθε φορά από τη θέση Α στη θέση Ρ

24 Λήξη Η επιμήκυνση σταματά σε ένα κωδίκιο λήξης (UGA, UAG ή UAA), επειδή δεν υπάρχουν tRNA που να αντιστοιχούν σε αυτά. Το κωδίκιο λήξης αναγνωρίζεται από τον παράγοντα απελευθέρωσης ο οποίος προκαλεί τη λήξη και την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας καθώς και τον αποχωρισμό των δύο υπομονάδων του ριβοσώματος.

25

26 Πολυσώματα (πολυριβοσώματα) Πολλά μόρια mRNA μπορούν να μεταγράφονται από ένα μόνο γονίδιο. Πολλά ριβοσώματα μπορούν να μεταφράζουν ταυτόχρονα ένα mRNA, το καθένα σε διαφορετικό σημείο κατά μήκος του μορίου. Αμέσως, μόλις το ριβόσωμα έχει μεταφράσει τα πρώτα κωδίκια, η θέση του mRNA είναι ελεύθερη για την πρόσδεση ενός άλλου ριβοσώματος. Το σύμπλεγμα των ριβοσωμάτων που δημιουργείται με το mRNA ονομάζεται πολύσωμα.

27

28 ΠΟΛΥΑΜΙΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ Ένας καθοριστικός παράγοντας που επηρεάζει τη δομή, και κατά συνέπεια τη λειτουργία του ριβοσώματος, είναι το ιοντικό περιβάλλον. Δισθενή και μονοσθενή κατιόντα (Mg +2, NH 4+, K + ), αλλά και οι πολυαμίνες αποτελούν απαραίτητα συστατικα για τη λειτουργική διαμόρφωση του ριβοσώματος. Επιπρόσθετα, σειρά μελετών υποστηρίζει την άμεση εμπλοκή του ιοντικού περιβάλλοντος σε λειτουργίες, όπως είναι ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού και η αποκωδικοποίηση του mRNA.

29 ΠΟΛΥΑΜΙΝΕΣ

30 ΠΟΛΥΑΜΙΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ Οι πολυαμίνες έχουν τη δυνατότητα να δράσουν ως κατιοντικοί αντικαταστάτες των ιόντων Mg+2. Σε in vitro συστήματα πρωτεϊνικής σύνθεσης, μπορούν και μειώνουν τη βέλτιστη συγκέντρωση ιόντων που απαιτείται. Η βέλτιστη συγκέντρωση των πολυαμινών σχετίζεται με το φορτίο τους. Όλες οι πολυαμίνες δεν έχουν την ίδια δραστικότητα. Σε ισομοριακές συγκεντρώσεις, αυτή αυξάνεται από τις διαμίνες προς τις τριαμίνες και από τις τριαμίνες προς τις τετραμίνες.

31 ΠΟΛΥΑΜΙΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ Παρουσία πολυαμινών, αυξάνεται η πιστότητα της μετάφρασης. Η παρουσία σπερμιδίνης, σε 6 mM Mg+2, ενισχύει την ειδικότητα στην αλληλεπίδραση κωδικόνιου-αντικωδικόνιου και μειώνει την ενσωμάτωση λάθος αμινοξέων. Η δράση αυτή εντοπίζεται κατά την πρόσδεση ενός αμινοακυλο- tRNA στο ριβόσωμα. Οι πολυαμίνες επηρεάζουν και την πεπτιδυλο- τρανσφεράση. Η καταλυτική σταθερά της διπλασιάζεται, όταν η σπερμίνη αυξάνεται από 0 σε 100 μΜ. Περαιτέρω αύξηση δρα ανασταλτικά.

32 Αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών. Αντιβιοτικά. Αντιβιοτικά υπάρχουν φυσικά και συνθετικά. Πολλά αναστέλουν τη σύνθεση πρωτεϊνών. Η στρεπτομυκίνη: είναι αμινογλυκοζίτης, αναστέλει τη λειτουργία των προκαρυωτικών ριβοσωμάτων. Η χλωραμφενικόλη αναστέλει την πεπτίδυλο- τρανσφεράσης σε προκαρυωτικά ριβοσώματα. Η τετρακυκλίνη αναστέλει τη σύνδεση του άμινο- άκυλο-tRNA (μικρή υπομονάδα). Το κυκλοεξιμίδιο αναστέλει τη δράση της υπομονάδας 60S. H πουρομυκίνη διακόπτει τη σύνθεση της αλυσίδας.

33

34

35 ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗ Η πουρομυκίνη εμποδίζει την ανάπτυξη μίας μεγάλης ποικιλίας προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων με το να εμπλέκεται στην πρωτεϊνική σύνθεση. Είναι δραστική εναντίον των θετικών κατά Gram βακτηρίων. Τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια και οι μύκητες είναι ανθεκτικοί, λόγω της μικρής διαπερατότητάς τους στο αντιβιοτικό. Τα κύτταρα του Streptomyces είναι πιο ανθεκτικά, διότι το γονιδίωμά τους περιέχει το γονίδιο Pac που κωδικοποιεί μία αμινοακετυλο-τρανσφεράση που απενεργοποιεί την πουρομυκίνη. Τα ζωικά κύτταρα είναι ευαίσθητα σε συγκεντρώσεις 1-10 μg/ml.

36 Χημικός τύπος πουρομυκίνης

37 ΔΡΑΣΗ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ Η πουρομυκίνη είναι ένα ανάλογο του 3΄ αμινοακυλο- tRNA, το οποίο δρα τόσο στα προκαρυωτικά, όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ως αναστολέας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η ανασταλτική της δράση οφείλεται καταρχήν στο ότι συναγωνίζεται τα αμινοακυλο-tRNAs για πρόσδεση στην Α-θέση. Επίσης, έχει τη δυνατότητα να σχηματίζει πεπτιδικό δεσμό με το εναρκτήριο fMet-tRNA ή το πεπτιδυλο- tRNA, που βρίσκεται στην Ρ-θέση του ριβοσώματος.

38 ΔΡΑΣΗ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ Το προϊόν αυτό και στις δύο περιπτώσεις δεν μπορεί να συμμετάσχει στα επόμενα στάδια πρωτεϊνικής σύνθεσης και αποχωρίζεται από το ριβόσωμα. Αυτό οφείλεται στο ότι η πουρομυκίνη δεν μπορεί να δράσει ως υπόστρωμα της Ρ θέσης, αφού ο δεσμός μεταξύ αμινοξέος και της νουκλεοζιτικής ομάδας της πουρομυκίνης είναι ένα αμίδιο και όχι ο ενεργός ακετυλεστέρας των φυσιολογικών αμινοακυλο-tRNA υποστρωμάτων. Επίσης για την πουρομυκίνη δεν υπάρχει tRNA να αλληλεπιδράσει με το mRNA και την 30S υπομονάδα.

39

40

41 ΑΛΛΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Οι τετρακυκλίνες και η στρεπτομυκίνη συνδέονται με την 30S ριβοσωματική υπομονάδα και εμποδίζουν τη σταθερή σύνδεση του m-RNA. Η χλωραμφενικόλη συνδέεται με την πεπτιδυλο- τρανσφεράση και αναστέλλει τη δράση της (στην 50S υπομονάδα).

42 ΧΛΩΡΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗ Θεωρείται πρωτότυπο ευρέος φάσματος αντιβιοτικό, παράλληλα με τις τετρακυκλίνες. Είναι αποτελεσματική κατά μεγάλης ποικιλίας Gram-θετικών και αρνητικών βακτηρίων, αερόβιων και αναερόβιων. Στις ανεπτυγμένες χώρες χρησιμοποιείται μόνο τοπικά για οφθαλμικές μολύνσεις. Σε χώρες με χαμηλό εισόδημα, εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως. Η πιο σοβαρή δυσμενής επίπτωση που συνδέεται με χλωραμφαινικόλη είναι η καταστολή μυελού των οστών και η απλαστική αναιμία, η οποία είναι ιδιάζουσα (σπάνια, απρόβλεπτη, και ασύνδετη με τη δόση) και γενικά θανατηφόρα.

43 Συνδέεται με τη μεγάλη υπομονάδα και αναστέλλει τη δραστηριότητα της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης. Οι παρενέργειες περιλαμβάνουν αναστολή του μιτοχονδριακού ριβοσώματος με αποτέλεσμα το "σύνδρομο του γκρίζου μωρού" και απλαστική αναιμία σε ευαίσθητα άτομα

44 ΑΜΙΝΟΓΛΥΚΟΣΙΔΕΣ Η στρεπτομυκίνη και άλλα μέλη της οικογένειας, π.χ. γενταμυκίνη και καναμυκίνη, αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση μέσω σύνδεσης με το rRNA της μικρής υπομονάδας και προκαλούν μεταφραστικά λάθη στην ανάγνωση κωδικονίων που οφείλονται σε αλλαγές διαμόρφωσης στο ριβόσωμα Οι παρενέργειες περιλαμβάνουν «ήχο σειρήνας» στα αυτιά και κώφωση. Επίσης, «παρεμβάλλονται» στην μιτοχονδριακή πρωτεϊνοσύνθεση.

45 ΣΤΡΕΠΤΟΜΥΚΙΝΗ-streptomycin

46 Gentamicin

47

48

49 ΤΟΞΙΝΗ ΔΙΦΘΕΡΙΤΙΔΑΣ Diptheria toxin. Διαθέτει ένζυμο που κωδικοποιείται από ένα βακτηριοφάγο στο βακτήριο Corynebacterium diphtheriae το οποίο χρησιμοποιεί το NAD+ καταλυτικά για να απενεργοποιήσει τον eEF2 μέσω ADP-ριβοζυλίωσης μίας ιστιδίνης στον παράγοντα αυτό

50 ΛΑΙΜΟΣ «ΒΟΟΣ», ΔΙΦΘΕΡΑ, ΝΕΚΡΩΣΗ

51 Η ΤΥΧΗ ΤΟΥ m-RNA ΤΕΧΝΟΛΟΛΟΓΙΕΣ ANTI-SENCE

52 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΟΣΥΝΘΕΣΗΣ

53 H ΣΥΝΘΕΣΗ ΦΕΡΙΤΙΝΗΣ Tfr: transferrin receptor, IRP1: Iron regulatory protein 1

54 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ