1 Άλλες τεχνικές διαχωρισμού, ανίχνευσης και ταυτοποίησης

2 Φυγοκέντρηση

3 Η φυγοκέντρηση χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μικρών ποσοτήτων διαλύματος Η πιο κοινή χρήση της είναι στο διαχωρισμό στερεής ουσίας που αιωρείται σε υγρό (όχι διάλυμα) Τα σωματίδια που είναι διασκορπισμένα σε ένα υγρό μείγμα καθιζάνουν λόγω βαρύτητας (1 x g) αν η πυκνότητά τους είναι μεγαλύτερη από αυτήν του μείγματος Ο χρόνος που απαιτείται για την καθίζηση όλων των αιωρούμενων σωματιδίων είναι αναμενόμενα πολύς για τα εργαστηριακά δεδομένα Πολύ μικρά σωματίδια ενδέχεται να μην καθιζάνουν καθόλου

4 Η φυγοκέντρηση του μείγματος ωθεί πιο γρήγορα τη στερεά ουσία στο πυθμένα του φυγοκεντρικού σωλήνα Η δύναμη που αναπτύσσεται στα σωματίδια (RCF) είναι πολύ μεγαλύτερη από τη δύναμη της βαρύτητας Ένα RCF 500 x g σημαίνει ότι το σωματίδιο υφίσταται επιτάχυνση ίση με 500 φορές την επιτάχυνση της βαρύτητας Δημιουργία ιζήματος Η υπερκείμενη υγρή φάση μπορεί να αφαιρεθεί εύκολα Φυγοκέντρηση

5 Pellet: το ίζημα που σχηματίζεται στον πυθμένα του σωλήνα μετά τη φυγοκέντρηση Υπερκείμενο - Supernatant: Το υγρό που μένει πάνω από το ίζημα μετά τη φυγοκέντρηση Rmax: Μέγιστη ακτίνα από τον άξονα του ρότορα Rmin: Ελάχιστη ακτίνα από τον άξονα του ρότορα Ορολογία

6 Φυγοκέντρηση Ν = rpm = revolutions per minute ω = γωνιακή ταχύτητα (rad/s) = 2πΝ / 60 R = ακτίνα περιστροφής (απόσταση σωματιδίου από τον άξονα) Φυγόκεντρος δύναμη = m ω 2 R Φυγόκεντρος επιτάχυνση = ω 2 R = 4π 2 Ν 2 R / 3600 = N 2 R

7 RPM: Revolutions Per Minute – στροφές ανά λεπτό (ταχύτητα) Επειδή οι ρότορες είναι διαφορετικοί μεταξύ τους, χρησιμοποιούμε την RCF Φυγοκέντρηση RCF: Relative centrifugal force – Σχετική φυγόκεντρος δύναμη

8

9 RCF = φυγόκεντρος δύναμη / βαρυτική δύναμη = = M ω 2 R / M g = ω 2 R / g = (2π Ν / 60) 2 R / g = = RCF = x R (Ν/1000) 2 Φυγοκέντρηση

10 Φυγοκέντρηση Στη δύναμη καταβύθισης m p ω 2 R αντιτίθενται Η τριβή μεταξύ του σωματιδίου και του διαλύτη = f ν f = συντελεστής τριβής ν = ταχύτητα σωματιδίου Η άνωση που δέχεται το σωματίδιο = m s γ = m s ω 2 R Συνολική δύναμη που ασκείται στο σωματίδιο F ολ = Δύναμη καταβύθισης – Δύναμη άνωσης – Δύναμη τριβής = F ολ = m p ω 2 R – m s ω 2 R – f v = (m p – m s ) ω 2 R – f v

11 Φυγοκέντρηση

12 m μάζα σωματιδίου f συντελεστής τριβής σωματιδίου και διαλύτη ρ πυκνότητα διαλύματος ν ταχύτητα σωματιδίου Υψηλότερη τιμή S  γρηγορότερη καταβύθιση σωματιδίου Moνάδα συντελεστή καταβύθισης Svedberg S ή Sv Μονάδα χρόνου sec (100fs) Μεγαλύτερη μάζα σωματιδίου  υψηλότερο S Υψηλότερη πυκνότητα σωματιδίου  υψηλότερο S Συμπαγές σωματίδιο  υψηλότερο S από ένα λιγότερο συμπαγές Υχηλότερη ταχύτητα περιστροφής  υψηλότερο S Συντελεστής καταβύθισης και Svedberg (S ή Sv) Τιμή S: συντελεστής καταβύθισης, ο αριθμός που πληροφορεί για το σχήμα και το μέγεθος του σωματιδίου.

13 Οι συντελεστές καταβύθισης δεν προστίθενται Όταν δύο σωματίδια με S1 και S2 προσδεθούν ο τελικός συντελεστής S δεν είναι άθροισμα S1+S2 Πχ ριβοσώματα Αποτελούνται από δύο υπομονάδες 50S και 30S Το ριβόσωμα έχει συντελεστή καταβύθισης 70S Συντελεστής καταβύθισης και Svedberg (S ή Sv)

14 Είδη φυγοκέντρησης Διαφορική φυγοκέντρηση Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας

15 Η κλασική μέθοδος φυγοκέντρησης Ο διαχωρισμός βασίζεται στο μέγεθος και το σχήμα των σωματιδίων Συχνή μέθοδος στο διασωρισμό κυττάρων από το θρεπτικό υλικό και υποκυτταρικών οργανιδίων από το κυτταρικό ομογενοποίημα Τα μεγαλύτερα σωματίδια μετακινούνται γρηγορότερα στον πυθμένα από ότι τα μικρότερα Φυγοκέντρηση σε μια ταχύτητα καταβυθίζει ένα συγκεκριμένο είδος σωματιδίων Τα υπόλοιπα μένουν στο υπερκείμενο Επαναφυγοκεντρηση υπερκείμενου σε υψηλότερη ταχύτητα Καταβύθιση σωματιδίων και επαναφυγοκέντρηση υπερκείμενου σε υψηλότερη ταχύτητα..... Διαφορική φυγοκέντρηση

16 Διαχωρισμός κυτταρικών υποσωματιδίων Κυτταρικό ομογενοποίημα Φυγοκέντρηση στα 600g για 10min  καταβύθιση ανέπαφων κυττάρων και πυρήνων (pellet) Φυγοκέντρηση υπερκείμενου στα 15000g για 10min  καταβύθιση μιτοχονδρίων, λυσοσωματίων, περοξισωματίων Φυγοκέντρηση υπερκείμενου στα g για 30-60min  καταβύθιση ριβοσωμάτων, μικροσωμάτων Φυγοκέντρηση υπερκείμενου στα g για 1-2h  καταβύθιση υπομονάδων ριβοσωμάτων  στο υπερκείμενο βρίσκονται οι διαλυτές πρωτεΐνες και το διαλυτό τμήμα του κυτταροπλάσματος Διαφορική φυγοκέντρηση

17 Διαφορική φυγοκέντρηση

18 Διαφορική φυγοκέντρηση Το δείγμα τοποθετείται καθ’όλο τον όγκο του σωλήνα φυγοκέντρησης Σε κάθε βήμα της φυγοκέντρησης ορισμένα σωματίδια καταλήγουν αναπόφευκτα στον πυθμένα Ορισμένα σωματίδια μπορεί να καταλήξουν και στα δύο κλάσματα (pellet και supernantant) Μέγεθος, σχήμα, και συνθήκες φυγοκέντρησης Επανάληψη φυγοκέντρησης σε υψηλότερη ταχύτητα Ίδια πυκνότητα σε όλο το δείγμα

19 Density gradient centrifugation Η προτιμώμενη μέθοδος διαχωρισμού υποκυτταρικών σωματιδίων και μακρομορίων Χρήση βαθμίδωσης πυκνότητας στο σωλήνα φυγοκέντρησης Βαθμίδωση πυκνότητας με το πυκνότερο στρώμα στον πυθμένα του δοχείου και το ελαφρύτερο στην κορυφή Διάλυμα σακχαρόζης (5-20%) Διαχωρισμός σωματιδίων με κριτήριο την πυκνότητα του διαλύματος και την πυκνότητα ή το μέγεθος των σωματιδίων Συλλογή κλασμάτων από τον πυθμένα του σωλήνα Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας

20 Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας Δύο κατηγορίες Βαθμίδωση ζώνης και Ισόπυκνη Sucrose, CsCl, Ficoll, Hypaque, Percoll

Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση ζώνης Βαθμίδωση διαλύματος σακχαρόζης 5-20% Πυκνότητα 1 < πυκνότητα 2 < πυκνότητα 3 < πυκνότητα 4 < πυκνότητα 5 <πυκνότητα 6 Το δείγμα τοποθετείται στην κορυφή του φυγοκεντρικού σωλήνα ως λεπτή στοιβάδα Στο τέλος της φυγοκέντρησης τα σωματίδια έχουν διαχωριστεί ανάλογα με το μέγεθος και τη μάζα τους Τα σωματίδια μπορούν να συλλεχθούν στο τέλος της φυγοκέντρησης ανοίγοντας μια οπή στον πυθμένα του σωλήνα Αρχή φυγοκέντρησης Τέλος φυγοκέντρησης

22 Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση ζώνης Χρήση για διαχωρισμό σωματιδίων με παρόμοια πυκνοτητα αλλά διαφορετικό μέγεθος Χρόνος φυγοκέντρησης Πολύ μικρός  μη σωστός διαχωρισμός Πολύ μεγάλος  καταβύθιση όλων των σωματιδίων ανεξαρτήτως μεγέθους Πυκνότητα μείγματος προς διαχωρισμό Μικρότερη από τη μικρότερη τιμή πυκνότητας της βαθμίδωσης Πυκνότητα σωματιδίων προς διαχωρισμό Μεγαλύτερη από τη μεγαλύτερη πυκνότητα της βαθμίδωσης Το μήκος της βαθμίδωσης πρέπει να είναι επαρκές

23 Πχ κατηγορίες αντισωμάτων Πολυμερή Ig IgG, IgE, IgD  μονομερή IgA  διμερές IgM  πενταμερές Μετατόπιση κάθε κατηγορίας σε διαφορετικό σημέιο στο σωλήνα Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση ζώνης

24 Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση συγκέντρωσης Συνήθως χλωριούχο καίσιο CsCl Το σωματίδιο καταβυθίζεται μέχρι το σημείο όπου η πυκνότητα του περιβάλλοντος διαλύματος να είναι ίση με την πυκνότητά του Άνωση αντίθετη στη φυγόκεντρο δύναμη Ισόπυκνη φυγοκέντρηση

25 Διαχωρισμός σωματιδίων με παρόμοιο μέγεθος αλλά διαφορετική πυκνότητα Η πυκνότητα των σωματιδίων του μείγματος πρέπει να είναι μεταξύ των ορίων της βαθμίδωσης Ο χρόνος πρέπει να είναι αρκετός για το διαχωρισμό 12-24h rpm Εφόσον φτάσεί το σωματίδιο σ’συτό το σημείο, επιπλέον χρόνος φυγοκέντρησης δεν επηρεάζει την καταβύθιση To δείγμα είναι ομοιόμορφα κατανεμημένο στο σωλήνα φυγοκέντρησης πριν τη φυγοκέντρηση Φυγόκεντρος δύναμη αντιτίθεται στην άνωση Ισόπυκνη φυγοκέντρηση

26 Ισόπυκνη φυγοκέντρηση Η μέθοδος του CsCl χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μείγματος νουκλεϊκών οξέων παρόμοιου ΜΒ Τα μόρια DNA διαχωρίζονται με βάση την αναλογία ζευγών AT προς GC Ένα ζεύγος ΑΤ έχει μικρότερη πυκνότητα από ένα ζεύγος GC Το μόριο DNA με τη μεγαλύτερη αναλογία ΑΤ έχει μικρότερη πυκνότητα Επίσης το γραμμικό χρωμοσωμικό DNA έχει μικρότερη πυκνότητα από το υπερσυσπειρωμένο πλασμιδιακό DNA......το οποίο με τη σειρά του έχει μικρότερη πυκνότητα από το RNA

27 Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας

28 Φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας

29 Φυγοκέντρηση – οι ρότορες Τρεις κατηγορίες ρότορα Swing-bucket – Ταλαντευόμενου κάδου Fixed angle – Σταθερής γωνίας Vertical – Κάθετοι

30 Swing-bucket – Ταλαντευόμενου κάδου Οι σωλήνες φυγοκέντρησης τοποθετούνται στους κάδους του ρότορα οι οποίοι είναι σε κάθετη θέση όταν ο ρότορας είναι σε ηρεμία Όταν ο ρότορας τίθεται σε λειτουργία οι κάδοι αιωρούνται σε οριζόντια θέση Χρήσιμος σε φυγοκεντρήσεις βαθμίδωσης πυκνότητας Μεγαλύτερο μήκος διαχωρισμού (εκμεταλλέυεται όλο το μήκος του σωλήνα) Καλύτερος διαχωρισμός Φυγοκέντρηση – οι ρότορες

31 Fixed angle – Σταθερής γωνίας ΟΙ σωλήνες κρατώνται σε σταθερή γωνία κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης Διαφορετικός προσανατολισμός διαλύματος μέσα στο σωλήνα Χρήσιμος για καταβύθιση (pelleting) κυττάρων καλλιεργειών Επίσης για ισόπυκνο διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων Φυγοκέντρηση – οι ρότορες

32 Vertical – Κάθετοι Κάθετη θέση σωλήνων κατά τη φυγοκέντρηση Ακατάλληλος για καταβύθιση Ο πιο κατάλληλος τύπος για ισόπυκνο διαχωρισμό (μικρό μήκος) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA, RNA, λιποπρωτεΐνες Φυγοκέντρηση – οι ρότορες

33 Ρότορες φυγοκέντρησης

34 Σωλήνες φυγοκέντρησης

35 Φυγοκέντρησης Ατύχημα με τη φυγόκεντρο Εξαιρετικά υψηλές ταχύτητες Προσοχή στις προδιαγραφές Μέγιστη ταχύτητα, μέγιστο βάρος και πυκνότητα δειγμάτων Ισορροπημένο φορτίο

36 Ηλεκτροφόρηση

37 Ηλεκτροφόρηση Κίνηση συστατικών ενός μείγματος σε διαμέσου ενός αγώγιμου υλικού εφαρμόζοντας ηλεκτρικό πεδίο Κατιοντικά συστατικά  αρνητικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο (κάθοδος) Ανιοντικά συστατικά  Θετικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο (άνοδος)

38 Ηλεκτροφορητική δύναμη  ταχύτητα μετατόπισης V V = μ Ε μ = η ηλεκτροκινητικότητα του συστατικού Ε = η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου Ηλεκτροφόρηση

39

40 ηλεκτροκινητικότητα μ = q / 6 π η r q = το φορτίου του συστατικού η = η πυκνότητα του υλικού διαχωρισμού r = η ακτίνα του συστατικού Υψηλό φορτίο Χαμηλή πυκνότηταΥψηλότερη ταχύτητα μετατόπισης Μικρή ακτίνα (μικρό μέγεθος) Ηλεκτροφόρηση

41 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή (gel electrophoresis) Ίσως η πιο πολυχρησιμοποιημένη μέθοδος στην ανάλυση των πρωτεϊνών Εάν ένα φορτισμένο μόριο τεθεί σε ηλεκτρικό πεδίο τότε πάνω του ασκείται μια δύναμη η οποία το αναγκάζει να κινηθεί Η ταχύτητα (υ) με την οποία θα κινηθεί εξαρτάται από την ένταση (Ε) του πεδίου το φορτίο του μορίου (z) την αντίσταση του υλικού (συντελεστής τριβής f) Το μέγεθος του μορίου (m) Τα διάφορα συστατικά διαχωρίζονται με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (P.A.G.E.)

42 Ακρυλαμίδιο-πολυακρυλαμίδιο Μείγμα ακρυλαμιδίου και Ν-Ν-μεθυλενο-bis-ακρυλαμιδίου Πολυμερισμός σε πολυακρυλαμίδιο

43 Ακρυλαμίδιο-πολυακρυλαμίδιο Παρουσία καταλύτη (υπερθειικό αμμώνιο) και TEMED

44 P.A.G.E. Ρυθμιστικό διάλυμα Mείγμα ακρυλαμιδίου/bis-ακρυλαμιδίου ΑΜΡ TEMED Γυάλινες πλάκες (glass plates) Spacers Χτενάκι (comb)

45 P.A.G.E Α – Υψηλό αρνητικό φορτίο Β – Χαμηλό ΜΒ Γ – Συμπαγής δομή

46 Αλλά… Οι πρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους στο μέγεθος, το σχήμα και στο φορτίο Αν μια πρωτεΐνη κινηθεί πιο γρήγορα από μια άλλη μπορεί να οφείλεται σε μεγαλύτερο φορτίο ή σε μικρότερο μέγεθος ή σε μια πιο συμπαγή δομή Η απλή ηλεκτροφόρηση δεν μας επιτρέπει να καθορίσουμε ούτε το ένα ούτε το άλλο Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή (gel electrophoresis)

47 Ηλεκτροφόρηση με χρήση SDS Εξουδετέρωση δύο από τις τρεις παραμέτρους Φορτίο και συμπαγής δομή Διαχωρισμός μόνο βάσει μεγέθους Ουσία η οποία θα προσδίδει σταθερό και ομοιόμορφο φορτίο στις πρωτεΐνες Ουσία η οποία θα εξουδετερώνει την τριτοταγή δομή της πρωτεΐνης Δωδεκάκυλο-θειικό νάτριο (sodium dodecyl sulfate - SDS)

48 Ηλεκτροφόρηση με χρήση SDS Απορρυπαντικό που προσδένεται στις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία (1 μόριο SDS ανά δύο αμινοξέα) Θέρμανση τους o C Παράμετρος «φορτίο» Προσδίδει ένα ομοιογενές ισχυρό αρνητικό φορτίο στις πρωτεΐνες Παράμετρος «σφαιρική δομή» Καταστροφή σχεδόν όλων των ιοντικών δεσμών της πρωτεΐνης Καταστροφή τριτοταγούς δομής Ο διαχωρισμός πλέον γίνεται μόνο βάσει του μεγέθους Δυνατότητα διαχωρισμού υπομονάδων πρωτεϊνών με τεταρτοταγή δομή logΜΒ

49 Πρωτεΐνες με δισουλφιδικούς δεσμούς Στοιχείο αναδίπλωσης πρωτεϊνών – συμπαγής δομή Το SDS δεν επηρεάζοι τους δισουλφιδικούς δεσμούς Προσθήκη β-μερκαπτοαιθανόλης ή DTT Διάσπαση δισουλφιδικών δεσμών Διαχωρισμός αλυσίδων που συνδέονταν με αυτούς Ηλεκτροφόρηση με χρήση DTT

50 Ηλεκτροφόρηση με χρήση SDS και DTT

Ηλεκτροφόρηση με χρήση SDS και DTT Μ SDS 3. SDS, DTT 1.

52 Eμφάνιση πρωτεϊνών με Coomassie Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες εμφανίζονται με χρώση της πηκτής με διάλυμα Coοmassie Brilliant Blue σε μεθανόλη και οξικό οξύ Η χρωστική βάφει τις πρωτεΐνες και την πηκτή με ένα βαθύ κυανό χρώμα Ακολουθεί αποχρωματισμός με μεθανόλη και οξικό όπου η χρωστική απομακρύνεται από την πηκτή αλλά όχι από τις πρωτεΐνες Οι πρωτεΐνες εμφανίζονται ως μπλε ζώνες σε ανοιχτόχρωμο φόντο

53 Η χρώση με άργυρο είναι μια τεχνική όπου χρησιμοποιείται άλας αργύρου ως μέσο χρωστικής Οι ζώνες των πρωτεϊνών έχουν καφέ-κίτρινο χρώμα Η μέθοδος είναι πιο πολύπλοκη από τη χρώση με Coοmassie αλλά ως και 100 φορές πιο ευαίσθητη Eμφάνιση πρωτεϊνών με χρώση αργύρου

54

55 Η μετακίνηση των πρωτεϊνών εξαρτάται και από το μέγεθος των πόρων του ακρυλαμιδίου στην πηκτή Αυτό εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου Για δείγματα με πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους παρασκευάζονται πυκνότερες πηκτές Πηκτές με χαμηλή συγκέντρωση πολυακρυλαμιδίου διαχωρίζουν καλύτερα πρωτεΐνες μεγάλου ΜΒ Πηκτές με βαθμίδωση συγκέντρωσης πολυακρυλαμιδίου Καλύτερος διαχωρισμός πρωτεϊνών μεγάλου και μικρού ΜΒ Ηλεκτροφόρηση

56

57 Ηλεκτροφόρηση

58 Ηλεκτροφόρηση με χρήση SDS + Γρήγορη τεχνική (~3h) κι εύκολη στη διαδικασία + Προσδιορισμός του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης + Ευαίσθητη τεχνική (0,1μg με χρώση με Coοmassie Brilliant Blue, ~1ng με χρώση με άργυρο) + Μπορεί να αναλύσει και να εμφανίσει πάνω από 50 πρωτεΐνες σε ένα δείγμα + Τροποποιημένες πρωτεΐνες (γλυκοζυλίωση) εμφανίζουν διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα + Οι μπάντες των πρωτεϊνών μπορούν να κοπούν από την πηκτή και να αναλυθούν εκτενέστερα - Μικρή παρασκευαστική ικανότητα - Μετουσίωση πρωτεϊνών όποτε η βιολογική τους δραστικότητα σχεδόν πάντα χάνεται

59 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων Ο διαχωρισμός μορίων νουκλεϊκών οξέων σε πηκτή αγαρόζης Αρνητικά φορτισμένα νουκλεϊκά οξέα  άνοδος Μόρια μικρού ΜΒ κινούνται γρηγορότερα Τα νουκλεϊκά οξέα είναι αρνητικά φορτισμένα Μετακίνηση προς την άνοδο

60 Ηλεκτροφόρηση αγαρόζης Πηκτή αγαρόζης Πολυσακχαρίτης κυτταρικού τοιχώματος φυκών 3,6-ανυδρογαλακτόζη

61 Αγαρόζη Διάλυση σκόνης αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα Θέρμανσή της στους >60 ο C Δημιουργία πορώδους τρισδιάστατου πλέγματος

62 Ηλεκτροφόρηση αγαρόζης

63 Τα μόρια του DNA που έχουν διαχωριστεί στην πηκτή αγαρόζης γίνονται ορατά με βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) Πρόσδεση του EtBr στο νουκλεϊκό οξύ (παρεμβλητικός παράγοντας - intercalating agent) Δυνατότητα ενσωμάτωσής του στην πηκτή κατά τη δημιουργία της Ή επώασης της πηκτής σε διάλυμα EtBr μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης Βρωμιούχο αιθίδιο

64 Το EtBr φθορίζει στο υπεριώδες όταν είναι ενσωματωμένο σε νουκλεϊκό οξύ Ευαισθησία ~20ng DNA Βρωμιούχο αιθίδιο ΚΑΡΚΙΝΟΓΟΝΟ!!!  Πριν τη χρώση με αιθίδιο Φωτογραφία πηκτής   Μετά τη χρώση με αιθίδιο και υπό UV φως

65 Αύξηση της περιεκτικότητας της πηκτής σε αγαρόζη επιτρέπει το διαχωρισμό μορίων μικρότερου μήκους Υψηλή τάση επιταχύνει τα μόρια DNA Παρόλα αυτά, η πηκτή μπορεί να λιώσει σε υψηλές τάσεις Τα μικρότερα μόρια νουκλεϊκών οξέων μετατοπίζονται περισσότερο πάνω στην πηκτή Κινητικότητα νουκλεϊκών οξέων

66 Η περιεκτικότητα σε αγαρόζη επηρεάζει και την κινητικότητα του δείγματος Κινητικότητα νουκλεϊκών οξέων

67 Σημαντικό ρόλο παίζει και η διαμόρφωση του μορίου Διαφορετική μετατόπιση θα έχει ένα ευθύγραμμο τμήμα DNA και διαφορετική ένα πλασμίδιο (κυκλικό μόριο) ίδιου μήκους (slowest to fastest): nicked or open circular, linearised, or supercoiled plasmid. Τα μόρια αναλύονται σε ευθύγραμμη διαμόρφωση Η μετατόπιση του γραμμικού DNA είναι αντιστρόφως ανάλογη με τον δεκαδικό λογάριθμο του ΜΒ του μορίου (ή των bp) Κινητικότητα νουκλεϊκών οξέων

68 Χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό τμημάτων DNA μετά από ενζυμική πέψη, PCR, στην χαρτογράφηση αλληλουχιών DNA + Ευκολία στην παρασκευή της πηκτής + Γρήγορη τεχνική + Τα δείγματα δεν μετουσιώνονται, ούτε καταστρέφονται με οποιονδήποτε τρόπο + Δυνατότητα επανάκτησης του μορίου που έχει αναλυθεί - Τοξικότητα αιθιδίου - Πιθανή τήξη της πηκτής σε υψηλές τάσεις Ηλεκτροφόρηση αγαρόζης

69 Ισοηλεκτρικός εστιασμός Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε βαθμίδωση ρΗ μεταξύ της ανόδου και της καθόδου Διαφορετικό φορτίο ανάλογα με το ρΗ Οι πρωτεΐνες μετακινούνται ανάλογα με το φορτίο τους Σταθεροποίηση κάθε πρωτεΐνης στο ισοηλεκτρικό της σημείο

70 Ηλεκτροφόρηση σε δύο διαστάσεις Συνδυασμός δύο ηλεκτροφορητικών διαδικασιών Πρώτη διαδικασία διαχωρισμού με ισοηλεκτρικό εστιασμό Δεύτερη διαδικασία διαχωρισμού με κανονική SDS-PAGE Μεγαλύτερη ανάλυση Διαχωρισμός περισσότερων πρωτεϊνών ( )

71 Ηλεκτροφόρηση σε δύο διαστάσεις Πρωτεομική Σύγκριση εκφραζόμενων πρωτεϊνών σε διαφορετικές συνθήκες

72 Western blott Ένας άλλος τρόπος να ανιχνευθει η ύπαρξη μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης είναι το Western blot ή ανοσοαποτύπωση Διαχωρισμός μείγματος πρωτεϊνών σε πηκτή SDS-PAGE Χρήση αντισωμάτων για ανίχνευση και ταυτοποίηση πρωτεΐνης Πρόσδεση ΜΟΝΟ σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη

73 Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση Μεταφορά πρωτεΐνών από την πηκτή σε ειδική μεμβράνη (νιτροκυτταρίνη ή PVDF) Επώαση μεμβράνης με αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη που θέλουμε να ανιχνεύσουμε Πλύση κι επώαση μεμβράνης με δεύτερο αντίσωμα που προσδένεται στο πρώτο αντίσωμα Το δεύτερο αντίσωμα με ειδικό ένζυμο το οποίο καταλύει μια αντίδραση Η αντίδραση δημιουργεί αποτύπωμα σε φωτογραφικό φιλμ Το αποτύπωμα βρίσκεται ΜΟΝΟ στο σημείο όπου υπάρχει η πρωτεΐνη που αναζητούμε Western blott

74 Western blott + Εξαιρετικά εξειδικευμένη διαδικασία + Ανίχνευση μόνο της πρωτεΐνης η οποία είναι ειδική για το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήσαμε + Ανίχνευση της πρωτεΐνης σε πολύ μικρή ποσότητα - Χρονοβόρα (~5h) - Πρέπει να υπάρχει αντίσωμα για την πρωτεΐνη

75 Southern και northern blott Αποτύπωση νουκλεϊκών οξέων

76 Southern blott Αποτύπωση DNA Διαχωρισμός τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Μεταφορά διαχωρισμένων τμημάτων DNA σε ειδική μεμβράνη (νιτροκυτταρίνη, nylon) Επώαση με DNA συμπληρωματικο με την αλληλουχία που θέλουμε να ανιχνεύσουμε (probe) Το probe είναι σημασμένο ειδικά (ένζυμο, ραδιενεργά etc) ώστε να δίνει σήμα Northern blott (RNA)

77 Διαπίδυση - Dialysis Σπανίως χρησιμοποιείται ως μέθοδος διαχωρισμού πρωτεϊνών Κεντρική θέση σε όλα σχεδόν τα πρωτόκολλα καθαρισμού Τα διαφορετικά βήματα καθαρισμού έχουν διαφορετικές προτιμήσεις όσον αφορά το διάλυμα στο οποίο πρέπει να βρίσκεται η πρωτεΐνη Το κάθε βήμα καθαρισμού αφήνει το διάλυμά σε διαφορετική κατάσταση από ότι ξεκίνησε Παράμετροι όπως pH ή ιοντική πυκνότητα (ή και τα δύο) συνήθως διαφέρουν Διαχωρισμός πρωτεΐνης από μικρότερα μόρια

78 Διαπίδυση Χρήση επιλεκτικά διαπερατών (ημιπερατών) μεμβρανών οι οποίες έχουν πόρους συγκεκριμένου μεγέθους Μόρια που έχουν μέγεθος ίδιο ή μικρότερο από τους πόρους της μεμβράνης μπορούν να περάσουν Το πρωτεϊνικό διάλυμα που έχει υψηλή συγκέντρωση άλατος εισάγεται μέσα στη μεμβράνη και ασφαλίζεται Η μεμβράνη εισάγεται σε διάλυμα που δεν περιέχει άλας

79 Διαπίδυση Το άλας διαπερνά τη μεμβράνη και εξισορροπεί σταδιακά τις συγκεντρώσεις μέσα κι έξω από τη μεμβράνη Συχνή αλλαγή του εξωτερικού διαλύματος βεβαιώνει ότι η συγκέντρωση του άλατος στο διάλυμα της πρωτεΐνης θα ελαχιστοποιηθεί Μπορεί να αυξηθεί η συγκέντρωση άλατος σε ένα πρωτεϊνικό διάλυμα, να αλλάξει το pH ή ακόμα και να αλλάξει εντελώς το διάλυμα

80 Διαπίδυση Πριν Μετά 1 Μετά 2

81 Διαπίδυση + Εύκολη αλλαγή διαλύματος στο οποίο βρίσκεται η πρωτεΐνη + Δυνατότητα διαχωρισμού από μόρια με μικρότερο μοριακό βάρος (ίσως και από πολύ μικρές πρωτεΐνες) - Χρειάζονται ώρες για την αλλαγή και εξισορρόπηση των συγκεντρώσεων αλλαγές διαλύματος είναι συνήθως απαραίτητες για να είμαστε σίγουροι ότι η πρωτεΐνη είναι στο διάλυμα που θέλουμε - Δεν ενδείκνυται για μεγάλους όγκους διαλύματος (<50-100ml)

82 Διήθηση Αποτελεσματική μέθοδος για τον διαχωρισμό μεγαλύτερων σωματιδίων από ένα υγρό μείγμα Χρήση διηθητικού χαρτιού (φίλτρο) Μείγμα Φίλτρο Κατάλοιπο Χωνί Διήθημα Διαχωρισμός μπύρας από τη μαγιά Φιλτράρισμα νερού Καφές φίλτρου

83 Εξάτμιση Ένα διάλυμα δεν μπορεί να διαχωριστεί στα συστατικά του με τις αναφερθείσες μεθόδους Φυγοκέντρηση-διήθηση Τα σωματίδια της διαλυμένης ουσίας είναι διασκορπισμένα καθ’όλη τη σύσταση του διαλύματος Σε ιοντικά διαλύματα η ουσία υφίσταται διάσταση Ομοιογενές διάλυμα Ομοιογενείς ιδιότητες

84 Στερεά ουσία διαλυμένη σε υγρό διαλύτη Μη-πτητική ουσία σε πτητικό διαλύτη Αύξηση της θερμοκρασίας ώστε να εξατμιστεί ο διαλύτης Απομάκρυνση διαλύτη Η διαλυμενη ουσία παραμένει ως κατάλοιπο στον πυθμένα του δοχείου Κρυστάλλωση διαλυμένης ουσίας Εξάτμιση

85 Δύο τεχνικές για την κρυστάλλωση Επαναφορά θερμασμένου διαλύματος σε κανονική θερμοκρασία Εξάτμιση διαλύτη σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Κρυστάλλωση

86 Επαναφορά θερμασμένου διαλύματος σε κανονική θερμοκρασία Η ίδια ποσότητα διαλύτη μπορεί να διαλύσει μεγαλύτερη ποσότητα ουσίας σε υψηλή θερμοκρασία Πτώση της θερμοκρασίας μετατρέπει ένα μη κορεσμένο διάλυμα σε κορεσμένο Κρυστάλλωση

87 Εξάτμιση διαλύτη σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Η εξάτμιση αφαιρεί μέρος ή και όλο το διαλύτη Υψηλότερη συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας Κορεσμένο διάλυμα  Υπέρκορο διάλυμα Περίσσεια ουσίας κρυσταλλώνεται Ώρες, μέρες, βδομάδες.... Διήθηση για το διαχωρισμό των κρυστάλλων Κρυστάλλωση

88 Διαχωρισμός στερεού από διαλύτη ΟΚ Διαχωρισμός διαλύτη από διάλυμα ??? Διαχωρισμός δύο υγρών ουσιών που αναμιγνύονται ??? Θέρμανση διαλύματος Εξάτμιση διαλύτη Συμπύκνωση ατμών διαλύτη όταν έρθουν σε επαφή με ψυχρή επιφάνεια Απόσταγμα Evaporation + Condensation = DISTILLATION Αποστακτήρας Αποσταγμένα αλλκοολούχα ποτά (vodka, gin, ούζο...) Απόσταξη

89 Διαχωρισμός μειγμάτων αναμείξιμων υγρών Διαφορετικά ΣΖ των υγρών συστατικών Στήλη κλασματικής απόσταξης Χαμηλή θερμοκρασία στην κορυφή της στήλης Υψηλή θερμοκρασία στο κάτω μέρος Εξάτμιση των υγρών συστατικών Οι ατμοί διοχετεύονται στη στήλη Οι ατμοί του συστατικού με το υψηλότερο ΣΖ θα ψυχθούν σε χαμηλότερο σημείο της στήλης (υψηλότερη θερμοκρασία) Το συστατικό με χαμηλότερο ΣΖ παραμένει στην αέρια φάση μέχρι να φτάσει στο σημείο της στήλης όπου η θερμοκρασία θα ισούται με το ΣΖ Κλασματική απόσταξη - FRACTIONAL DISTILLATION είσοδος έξοδος Τ ( ο C)

Κλασματική απόσταξη

91 SEPARATING FUNNEL Διαχωρισμός υγρών συστατικών που δεν αναμιγνύονται Διαφορετική πυκνότητα Ηθμός με βαλβίδα Το υγρό με τη χαμηλότερη πυκνότητα σχηματίζει στρώμα επάνω από το υγρό με την υψηλή πυκνότητα Άνοιγμα βαλβίδας – συλλογή πυκνότερου υγρού σε δοχείο Κλείσιμο βαλβίδας – συλλογή αραιότερου υγρού σε άλλο δοχείο Ηθμός διαχωρισμού

92 Διαχωρισμός συστατικού από μείγμα συστατικών Ανάλογη με τη χρωματογραφία Μείγμα συστατικών σε διαλύτη Α (συνήθως υδατικό) Προσθήκη διαλύτη Β μη αναμείξιμου με τον Α (οργανικός διαλύτης) Ανακίνηση Διαφορά διαλυτότητας συστατικών στους δύο διαλύτες Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων Εκχύλιση με διαλύτη - SOLVENT EXTRACTION

93