George Orwell, Animal Farm

3

 Δημοφιλή μοντέλα στη βιολογία: House mouse Yeast Escherichia coli Corn Caenorhabditis elegans Arabidopsis Zebrafish  Το πιο δημοφιλές όλων: Drosophila

 61 % των ανθρώπινων νοσημάτων έχουν αναγνωρίσιμο αντίστοιχο στο γονιδίωμα της δροσόφιλας  50 % των πρωτεϊνικών αλληλουχιών έχουν ανάλογα στα θηλαστικά Η Drosophila:  Χρησιμοποιείται σε γενετικές προσομοιώσεις ανθρώπινων νοσημάτων, συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Parkinson, Alzheimer και Hantington  Χρησιμοποιείται για τη διαλεύκανση μοριακών μηχανισμών ανοσίας, διαβήτη, καρκίνου και εθισμού  Χρησιμοποιείται ως μοντέλο για την έρευνα πολλών αναπτυξιακών και κυτταρικών διαδικασιών των ανώτερων ευκαρυωτών, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου Η ανάπτυξη στη Drosophila και στον άνθρωπο είναι ομόλογες διαδικασίες. Στη Drosophila, όμως, μπορούμε να κάνουμε πειράματα που δεν μπορούν να γίνουν στον άνθρωπο. Ως αποτέλεσμα είναι το γεγονός ότι τα περισσότερα τα οποία γνωρίζουμε για την ανάπτυξη των ευκαρυωτικών οργανισμών βασίζεται σε πειράματα που έχουν γίνει στο μοντέλο Drosophila

10 DAYS Φτηνή και εύκολη η εκτροφή της Απλό γονιδίωμα Ύπαρξη μεταλλαγμάτων Metazoan: ανάπτυξη, συμπεριφορά, γενετικές ασθένειες Πολλά συγγενικά είδη: πληθυσμιακές και εξελικτικές μελέτες wt gene mutant

Μέθοδος τυχαίας προσπέλασης Μέθοδος τυχαίας προσπέλασης Whole genome shotgun method Whole genome shotgun method 8

 Craig Venter, 1990 (για βακτηριακά γονιδιώματα): ◦ Πρόοδος τεχνολογίας αλληλούχησης ◦ Αυξανόμενη υπολογιστική ισχύς  Δημιουργία κλώνων πολλών χιλιάδων μικρών τμημάτων (σε ισάριθμα πλασμίδια)  Μαζική αλληλούχηση τυχαίων κλώνων  Συναρμολόγηση των αναγνώσεων χωρίς πρότερη γνώση της θέσης τους στο γονιδίωμα 9

 H Celera πρώτα εφάρμοσε την προσέγγιση της τυχαίας προσπέλασης στη Δροσόφιλα: ◦ Κατάτμησε και κλωνοποίησε το γονιδίωμα της δροσόφιλας σε τρεις διαφορετικές βιβλιοθήκες ◦ Αλληλούχησε και από τα δύο άκρα 1,5 εκατ κλώνους ◦ Ο Eugene Meyers ανέπτυξε νέους αλγόριθμους για τη συναρμολόγηση  Κάλυψη των 2/3 του γονιδιώματος  Όχι χρωματίνη  Σημαντικός αριθμός χασμάτων  Πρώτη πρόχειρη και πολύ χρήσιμη εφαρμογή της τυχαίας προσπέλασης σε οργανισμό με μεγάλο γονιδίωμα 10

11

13 Διαγραμματική απεικόνιση των πολυταινικών χρωμο- σωμάτων των σιελογόνων αδένων της Drosophila.

 Το μέγεθος του γονιδιώματος: 180 Mb  Τα 2/3 είναι ευχρωματίνη  Αυτές οι 120 Mb ήταν το πρώτο μεγάλο γονιδίωμα που αλληλουχήθηκε ◦ Celera Genomics (Venter) ◦ Drosophila Genome Projects (Berkeley, CA and Europe)  Η ετεροχρωματίνη περιέχει πολλές αλλεπάλληλες επαναλήψεις της αλληλουχίας AATAACATAG και σχετικά λίγα γονίδια

 21% είναι υψηλά επαναλαμβανόμενες δορυφορικές αλληλουχίες στην ετεροχρωματίνη και το Υ χρωμόσωμα  3% επαναλαμβανόμενα γονίδια των rRNA, 5s RNA και ιστονών  9% σε 50 οικογένειες μεταθετών μεγέθους 2-9 kb  Τα τελομερή δεν έχουν απλές επαναλήψεις  Tα τελομερή έχουν αλληλουχίες μεταθετών στοιχείων  67% των μοναδικών αλληλουχιών είναι στην ευχρωματίνη και αποτελούν περίπου 13,600 γονίδια

 13,600 γνωστά ή προβλεπόμενα γονίδια: διπλάσια της ζύμης, λιγότερα του C. elegans και πολύ λιγότερα των 27,000 του Arabidopsis thaliana  Ένα γονίδια κάθε 9 kb  Για τις μισές πρωτεΐνες υπάρχουν ομόλογες στα θηλαστικά  Το ένα τρίτο έχει ομόλογες στους νηματώδεις  61% ανθρώπινων γονιδίων ασθενειών έχουν ομόλογα στις μύγες  30% των γονιδίων δεν σχετίζονται με γονίδια άλλων οργανισμών  Μόνο 4000 γονίδια είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα

 44% ομολογία ανάμεσα σε Drosophila και άνθρωπο  25% ομολογία ανάμεσα σε άνθρωπο και C. elegans  23% ομολογία ανάμεσα σε Drosophila και C. elegans

Mark D. Adams et al. The Genome Sequence of Drosophila melanogaster / Science, 2000 Stephen Richards et al. Comparative genome sequencing of Drosophila pseudoobscura: Chromosomal, gene, and cis-element evolution / Genome Research, 2005 Drosophila 12 Genomes Consortium. Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny / Nature, 2007

 Η μεγαλύτερη προβλεπόμενη πρωτεΐνη είναι η Kakapo αμινοξέων  Η μικρότερη είναι η ριβοσωμική πρωτεΐνη L38, 21– αμινοξέα  56,673 προβλεπόμενα εξόνια, κατά μέσο όρο 4 ανά γονίδιο = 24.1 Mb της συνολικής ευχρωματινικής αλληλουχίας  Το μέγεθος του μέσου προβλεπόμενου μεταγράφου είναι 3058 bp  Ταυτοποιήθηκαν 292 γονίδια tRNA και 26 για τα μικρά πυρηνικά RNAs του σωματίου ματίσματος (snRNAs)

 H γονιδιωματική αλληλουχία έριξε φως σε ορισμένες διαδικασίες που είναι κοινές σε όλα τα κύτταρα, όπως η αναπνοή, ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων κατά τη μείωση και μίτωση, ο μεταβολισμός του σιδήρου και άλλα  Υπάρχουν ορισμένα σημαντικά ευρήματα για ορισμένες ομάδες πρωτεϊνών που διαλευκαίνουν τη γονιδιακή ρύθμιση και τον κυτταρικό κύκλο  Η αντιστοιχία των πρωτεϊνών της Drosophila που εμπλέκονται στη γονιδιακή ρύθμιση και το μεταβολισμό με εκείνες του ανθρώπου, επιβεβαιώνει το γιατί η Drosophila αποτελεί ένα κατάλληλο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη ανθρώπινων νοσημάτων

 Η μεγάλη ποικιλία των μεταγραφικών παραγόντων πιθανά σχετίζεται με τη σημαντική ρυθμιστική πολυπλοκότητα της μύγας  Δεν υπάρχει ξεκάθαρο όριο ανάμεσα στην ευχρωματίνη και την ετεροχρωματίνη  Σε μια περιοχή περίπου 1 Mb υπάρχει μια σταδιακή αύξηση της πυκνότητας των μεταθετών στοιχείων και άλλων επαναλήψεων, στο σημείο που όλη η αλληλουχία είναι σχεδόν επαναλήψεις

25

26

27

28

Mosquitoes Order : Diptera ToxorhynchitinaeAnophelinaeCulicinae Family: Culicidae AedesCulexAnopheles

Anopheline fossile (20 Myr) s/amber/critters/skeeter-b.html (Amber from the Dominican Republic) Dr. David Grimaldi Cretaceous carnivorous dinosaures (145-65Myr) Oldest Culicidae-like fossile: Myr (canadian amber)

Γένος: Anopheles AfricaAsiaAmerica An. gambiae An. arabiensis An. funestus An. stephensi An. farauti An. sinensis An. tellessarus An. minimus An. albimanus An. quadrimaculatus An. darlingi An. freeborni Κύριοι φορείς νόσων: περίπου 70 είδη μεταδίδουν ελονοσία στους ανθρώπους περίπου 20 είναι σημαντικοί φορείς νόσων

- An. gambiae M et S - An. arabiensis - An. melas - An. merus - An. bwambae - An. quadriannulatus - An. quadriannulatus B Anopheles gambiae complex

Golden Path length ~ 273 Mb ( from:

Genome size:- 278 Mb ( 273 Mb ) scaffolds scaffolds => 91% of the genome contigs Inter-scaffold gaps: - sequence gaps, no clones - repeat sequences - smaller scaffolds ? Y chromosome: - no assembly - ongoing ? 0.18Mb - high repeat content Current release AgamP3 last update: 2/2006 First draft: March 2002

Mb Anopheles gambiae chromosomes ++ adapted from:

20 genes (1999) genes (2005) Cross disciplinary research: - Drosophila community - Bioinformaticiens - other domains - BLAST Fieldwork: - Entomologists - Identification follow-up of mutations adapt strategy

Κοινός πρόγονος Anopheles gambiae Drosophila melanogaster 250 ~ 273 Mb annotated genes (13765 in AgamP3) ~ 130 Mb annotated genes

 Το γονιδίωμα του Anopheles είναι διπλάσιο αυτού της Drosophila  Τα θηλυκά Anopheles τρέφονται με αίμα που είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των αυγών  Ιοί και παράσιτα χρησιμοποιούν τα ανωφελή κουνούπια ως φορείς για τη μετάδοσή τους

Adapted from Waters, Science,301 (2003) Adapted from: James, A.A., (2003),206:

Σποροζωίτες - εισβολή, ειδικοί υποδοχείς - εκκριτικά κύτταρα - αποθήκευση - επίδραση σε κανονικές λειτουργίες Σάλιο - πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αιματοφαφία - τροποποίηση της ανοσολογικής απόκρισης

AgamP3 Moz2a v.34

Adapted from Waters, Science,301 (2003) Vector eradication

Εντομοκτόνα Παρακολούθηση γονιδίων ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα - Ανθεκτικότητα σε πυρεθροειδή - Επιδημιολογία Ένζυμα αποτοξικοποίησης Detox-chip Νέοι στόχοι

Adapted from Waters, Science,301 (2003) Host - vector relationship

ΣυμπεριφοράΥποψήφια γονίδια: - όσφρηση79 δυνητικοί οσφρητικοί υποδοχείς - γεύση76 δυνητικοί γευστικοί υποδοχείς Ελκυστικά/Απωθητικά – Εντοπισμός ξενιστή Vectorial capacity (μολυσματική ικανότητα) Σύζευξη Ωοαπόθεση Παγίδες

Adapted from Waters, Science,301 (2003) Παρεμπόδιση της μετάδοσης - SM1

SM1 = salivary gland and midgut peptide 1 (Gosh, et al. 2000) 12 amino acids transgenic mosquitoes: - midgut expression - blocking plasmodium - salivary gland expression - blocking invasion - selective advantage of transgenic mosquitoes - proof of principle => Marrelli et al., PNAS 104, 2007

Adapted from Waters, Science,301 (2003) Ανοσοποιητικό σύστημα

Φυσικό και αποτελεσματικό ανοσοποιητικό σύστημα - Ανθεκτικότητα απέναντι στο Plasmodium - melanotic encapsulation – πολλοί γενετικοί τόποι - Ταυτοποίηση γονιδίων - Πολλαπλασιασμός και εξαπόλυση φυσικά ανθεκτικών στελεχών

Adapted from Waters, Science,301 (2003) Σιελογόνοι αδένες

cDNAs RT-PCR Πρωτεϊνική έκφραση Ανάλυση μεταγραφώματος Πρωτεομικές μελέτες σιελογόνων αδένων και σιέλου Σχέση ανάμεσα σε σιελογόνους αδένες και σποροζωίτες Σάλιο και άνθρωπος: immunomodulatory Λειτουργία? Στόχος εμβολίου?

54

55

 Ορθόλογα γονίδια σε έντομα και σπονδυλωτά 56

 Πρωτεϊνικές επικράτειες 57

58

59

60  CYP450 genes in M. domestica (red) and D. melanogaster (green)  Detox genes ◦ Cytochrome P450 ◦ Esterases ◦ Conjugation enzymes ◦ Musca has 146 (+11 pseudo) P450s ◦ Drosophila has 86

61

62 Μονήρης φάση Αγελαία φάση

63

 Πολύ μεγάλο γονιδίωμα (6,5 Gb) ◦ Τεράστιος αριθμός επαναλαμβανόμενων στοιχείων (>60%)  Αυξημένος αριθμός γονιδίων: ◦ Κατανάλωσης ενέργειαςπτήσεις μεγάλων αποστάσεων ◦ Αποτοξικοποίησηςπολυ-φυτοφαγία  Περίτεχνοι μηχανισμοί ρύθμισης, σχετιζόμενοι με την αλλαγή από τη μονήρη φάση στην αγελαία 64

 The i5k initiative 65

66

1. Καθορισμός προτεραιοτήτων και προώθηση προγραμμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης 2. Παροχή κατευθυντήριων γραμμών για το σχεδιασμό και την εφαρμογή προγραμμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης αρθροπόδων 3. Κατάρτιση επιστημόνων στα εργαλεία που χρειάζονται τα προγράμματα γονιδιωματικής ανάλυσης αρθροπόδων 4. Προώθηση συζητήσεων για τη μείωση περιττών προσπαθειών και την ενίσχυση των επιπτώσεων προγραμμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης αρθροπόδων, και 5. Παρουσίαση προτάσεων σε χρηματοδοτικούς οργανισμούς για την υποστήριξη νέων προγραμμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης αρθροπόδων 67

68