Κυτταρομετρία ροής Κατερίνα Ψαρρά Τμήμα Ανοσολογίας Ιστοσυμβατότητας ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»

Μέτρηση Ποσοτικοποίηση όσο το δυνατόν περισσοτέρων κυτταρικών συστατικών σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων Ποσοτική δομική ανάλυση των κυτταρικών συστατικών και των αλληλεξαρτήσεών τους Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών λειτουργιών Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων Πρωτόκολλα προτύπωσης

ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗΣ ΡΟΗΣ Laser Light 488nm FL2 PE SSC FSC Fluidics Electronics Computer FL3 PerCP, Cy5 FL1 FITC Light detectors

Κυτταρομετρητής ροής

Ορισμός Αυτόματη μικροσκοπία φθορισμού και φωτός μεμονωμένων κυττάρων σε ροή Πολυπαραμετρική ανάλυση: σκέδαση φθορισμός Κυτταρομετρία ροής Flow cytometry Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data

απορρίματα ανιχνευτής δείγμα Κυτταρομετρία ροής Flow cytometry Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data

Υδραυλικόυδροδυναμική εστίαση Laser Argon laser (blue), HeNe laser (red) Οπτικόθάλαμος ροής, ανιχνευτές, φίλτρα Ανίχνευσηφωτοπολλαπλασιαστές (PMT) Συλλογή δεδομένων απόκτηση, ερμηνεία, παρουσίαση (ηλεκτρονικός υπολογιστής) Κυτταρομετρία ροής Flow cytometry Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data

Κυτταρομετρητής ροής

Γραφική Αναπαράσταση Κυτταρομετρητή Ροής

Θάλαμος ροής

Υδροδυναμική εστίαση

Ταχύτητα

Οπτικό σύστημα

Πρόσθιος σκεδασμός (FSC) < 10° σκέδαση μέγεθος Πλάγιος σκεδασμός (SSC) 90° σκέδαση ~ κοκκίωση Laser Y Ένταση φθορισμού Πυκνότητα αντιγόνου Οπτικό σύστημα και Κύτταρο

Σκέδαση

Οπτικό Σύστημα Optical Path XL

Κυτταρομετρητής ροής 3 χρωμάτων κάτοψη

Κυτταρομετρητής ροής 6 χρωμάτων

SSC PMT 1 PMT 2 PMT 3 PMT 5 PMT DLP 500 LP 600 DLP 550 DLP 525 BP FITC 575 BP PE 645 DSP 620 BP ECD PC7 675 BP 755 LP PC5 710 DLP Οπτικό σύστημα Flow cytometry Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data

Laser Sample Sheath Waste Detector Κυτταρομετρητής ροής Flow cytometry Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data

Απόκτηση Ερμηνεία Παρουσίαση αποτελεσμάτων

Acquisition Analysis DI/LIS Patient report Data Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data Flow cytometry

λεμφοκύτταρα μονοκύτταρα κοκκιοκύτταρα CD45-FITC CD14-PE Συνδυασμός σκεδαστικών χαρακτηριστικών «μορφολογική» παρουσίαση υποπληθυσμών λευκοκυττάρων «ανοσολογική» παρουσίαση υποπληθυσμών λευκοκυττάρων Ανάλυση πλήρους αίματος μετά τη λύση των RBC Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data Flow cytometry

Ιστογράμματα κατανομής συχνοτήτων Ιστογράμματα μιας παραμέτρου TOTAL COUNT Σχετική ένταση φθορισμού Negative Positive Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data Flow cytometry

70% 30% 60% 40% LFL1 LFL2 20% 40% 30% 10% +/- +/+ -/+ -/- Στικτογράμματα – dot plots Ιστογράμματα δύο παραμέτρων Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data Flow cytometry

Παρουσίαση δεδομένων Plot types Dot Plot Density Plot Contour Plot Surface 3D Plot Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data Flow cytometry

Παρουσίαση δεδομένων Flow cytometry Focussing Sample Laser Optics Detection Settings Data

Μέτρηση υψηλού αριθμού κυττάρων σε σύντομο χρονικό διάστημα Ανίχνευση σπανίων δεδομένων (1: ) Ταυτόχρονη ανίχνευση δύο μορφομετρικών και τεσσάρων (ή περισσοτέρων) παραμέτρων φθορισμού ανά κύτταρο ( > 6 παραμέτρους ανά κύτταρο) Η ανάλυση μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή επιτρέπει τυποποίηση των κυτταρικών πληθυσμών Ευαισθησία (1:10000 – 1: ) Πλεονεκτήματα κυτταρομετρίας ροής

Εφαρμογές της Κυτταρομετρίας Ροής Τυποποίηση Λευχαιμιών /Λεμφωμάτων Μελέτη της πλοειδίας και των φάσεων του κυτταρικού κύκλου των Αιματολογικών κακοηθειών Παρακολούθηση Μεταμοσχεύσεων Παρακολούθηση θεραπειών Αυτοάνοσα Νοσήματα HLA-τυποποίηση Διάγνωση PNH Ποσοτικοποίηση των Αρχέγονων Αιμοποιητικών κυττάρων Θετική διαλογή προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων Μέτρηση των ΔΕΚ Παρακολούθηση της Σήψης Οξειδωτική έκρηξη - Φαγοκυττάρωση Μελέτη του ανοσοφαινότυπου της Λευχαιμικής Υπολειμματικής Νόσου Βασικός έλεγχος των HIV+ ατόμων Ανοσολογικές Ανεπάρκειες Μελέτη της ενεργοποίησης των Αιμοπεταλίων DNA-Ανάλυση Μελέτη της αντοχής στα χημειοθεραπευτικά Μελέτη της Απόπτωσης Αιματολογία Ανοσολογία Λοιμωξιολογία Ογκολογία Ουρολογία Μαιευτική και Γυναικολογία Στον τομέα των Μεταμοσχεύσεων Παιδιατρική Παθολογοανατομία Κυτταρολογία Πνευμονολογία Νευρολογία Οφθαλμολογία

Ηλεκτρονικά ανιχνευτές lasers Τεχνικές ανάλυσης δεδομένων Πολυπαραμετρική ανάλυση Αντιδραστήρια Φθορίζουσες ουσίες

Πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής: μια χρωματική έκρηξη Ηλεκτρομηχανολογικός εξοπλισμός – Hardware Αντιδραστήρια Ανάλυση δεδομένων Απεικόνιση δεδομένων « Χειροκίνητη » ανάλυση Αυτοματοποιημένη ανάλυση Εφαρμογές - συμπεράσματα

ΑΚΤΙΝΕΣ LASER Μια πηγή (488 nm) Δύο πηγές (488 nm nm) Τρεις πηγές Αργού (Ar) Κρυπτού (Κr) Ηλίου - Νέου (He-Ne) Ηλίου - Καδμίου (He-Cd ) Πράσινα lasers (532nm) ευκρίνεια  ευαισθησία 

ERYTHROBLAST CD36 Glycophorin A RETICULOCYTE Glycophorin A CD13 CD14 CD15 CD33 CD115 CDw116 CD123 MONOBLAST CD13 (CD15*) CD33 CD38 CD116 CD123 MYELOBLAST MYELOCYTE BONE MARROW BLOOD TISSUE ERYTHROCYTE (RED BLOOD CELL MEGAKARYOBLAST CD61 CD33 CD34 CD38 CD117 CD123 CD135 HLA-DR CFU-GEMM MYELOID STEM CELL MEGAKARYOCYTE CD41 CD42a CD42b CD42c CD42d ALL LEUCOCYTES (WHITE BLOOD CELLS) CD11a CD47 CD58 CD118 CD18 CD50 CD59 CD120a CD29 CD53 CD62L CD120b CD44 CD54 CD82 CD126 CD45 CD55 CD100 CD130 CD46 PLATELETS CD9 CD41 CD49b CD61 CDw17 CD42a CD49f CD23 CD42b (CD51) CD31 CD42d CD42c CD60 CD109 CD36 ACTIVATED PLATELETS CD62P CD63 CD107a CD107b MONOCYTE (CD4) CD32 CD49b CD85 CD9 CD33 CD49f CD87 CD116 CD11c CD36 CD63 CD89 CD38 CD64 CD121b CD13 (CD40) CDw92 CD123 CD14 CD43 CD68 CD93 CD127 CD15 (CD45RO) CD98 CD128 CDw17 (CD45RA) CD101 HLA-DR (CD31) (CD45RB) NEUTROPHIL CD10 CD66a CD15 CD66d CD16b CD89 CD17 CDw92 CD24 CD93 CD32 CD116 CD35 CD123 CD43 CD128 PROMONOCYTE CD13 CD14 (CD15) CD33 CD115 CD116 CD123 ACTIVATED NEUTROPHIL CD64 CD66 MYELOID Normal Maturation MACROPHAGE CD11c CD63 CD14 CD16 CD71 CD26 CD31 CD87 CD32 CD88 CD36 CD101 CD45RO CD45RB CD121b ACTIVATED MACROPHAGE CD23 CD25 CD69 CD105 PLURIPOTENT STEM CELL CD34 CD90 CD117 CD123 HLA-DR CD13 (CD15*) CD33 CD116 CD123 CD35 CD44 CD55 Glycophorin A ANTIGENS ON THE SURFACE OF BLOOD CELLS RED BLOOD CELLS PLATELETSGRANULOCYTESMONOCYTES

Οργανικές Δίδυμες (tandem) Quantum dots (νανοτεχνολογία) Ευρύτερα φάσματα διέγερσης Στενότερα φάσματα εκπομπής

COMPENSATION χρωματική αντιστάθμιση Πριν ή εκ των υστέρων;

Ηλεκτρονική επεξεργασία δεδομένων - απεικόνιση Η χρήση της logicle κλίμακας

Ανάλυση αποτελεσμάτων 4 χρώματα  16 υποπληθυσμοί «Αρκετά ταλαιπωρήθηκα να φθάσω ως εδώ…»

Ο δεκάλογος του «μοντέρνου» κυτταρομέτρη Διάλεξε τον κατάλληλο συνδυασμό αντιδραστηρίων (όσο το δυνατόν περισσότερα μονοκλωνικά στο ίδιο σωληνάριο) Χρησιμοποίησε τα σωστά δείγματα ελέγχου της χρωματικής αντιστάθμισης Χρησιμοποίησε χρώσεις για τη διάκριση ζωντανών/ νεκρών Χρησιμοποίησε αυτοματοποιημένα εργαλεία σχεδιασμού πρωτοκόλλων Ρύθμισε σωστά το όργανο Σύλλεξε δεδομένα χωρίς αντιστάθμιση Αποθήκευσε και αρχειοθέτησε με ασφάλεια τα δεδομένα Χρησιμοποίησε διαδοχικές οριοθετήσεις κλπ

«Χειροκίνητη» Ανάλυση Τιμή cut-off Διαδοχικές οριοθετήσεις Κόπος Τεχνητοί πληθυσμοί (artefacts) Προκατάληψη (bias)

Αυτοματοποιημένη ανάλυση Clustering Συστοιχίες Αλλά Απαιτείται περιορισμός πηγών ποικιλότητας

Έλεγχος ποιότητας : όλα τα σωληνάρια όμοια CD45 / SS

Αυτόματος αλγόριθμος για την ταυτοποίηση διαφορετικών υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων

Αναλυτικά βήματα για την ταυτοποίηση κυτταρικών υποπληθυσμών του BM με βάση τα CD13, CD33, CD34, CD45

Συγχωνευμένα αρχεία

Τα ενδοκυττάρια μονοπάτια και η κυτταρομετρία ροής Από τη μορφολογία στο γονότυπο

Ανάλυση εικόνας

In vivo κυτταρομετρία ροής

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ