ΕΚΦΕ ΑΓ. ΑΝΑΡΓΥΡΩΝ Θέμα: Μικροσκοπική παρατήρηση φυτικών και ζωϊκών κυττάρων Εισηγήτρια: Παντερή Ειρήνη, Βιολόγος, συνεργάτης ΕΚΦΕ Αγ. Αναργύρων

Λίγα λόγια για το μικροσκόπιο... Ως οπτικά ή φωτονικά μικροσκόπια αναφέρονται αυτά που χρησιμοποιούν το τμήμα του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που είναι ορατό, δηλαδή από nm. Το οπτικό μικροσκόπιο λέγεται και σύνθετο μικροσκόπιο γιατί η λειτουργία του στηρίζεται σε ένα σύστημα φακών. Η δυνατότητα διάκρισης των διαφόρων τμημάτων του κυττάρου οφείλεται στο γεγονός ότι τα διάφορα συστατικά του κυττάρου απορροφούν ή διαθλούν το φως σε διαφορετικό βαθμό. Το απλούστερο μικροσκόπιο είναι ένας απλός μεγεθυντικός φακός, ο οποίος όμως δεν ξεπερνά μία μέγιστη μεγέθυνση της τάξης του 20x

Μικροσκόπιο Προσοφθάλμιος φακός Αντικειμενικοί φακοί Τράπεζα Συμπυκνωτής φακός Μακρομετρικός κοχλίας Μικρομετρικός κοχλίας Διακόπτης Πηγή φωτός Φορέας αντικειμενικών φακών

Σε όλα τα μικροσκόπια μεγαλύτερη σημασία έχει:  η μεγέθυνση και  η διακριτική ικανότητα: ελάχιστη απόσταση που μπορεί να υπάρχει ανάμεσα σε δύο σημεία ώστε αυτά να φαίνονται σα δύο ξεχωριστά σημεία και όχι σαν μία συγκεχυμένη εικόνα

Διακριτική ικανότητα οπτικού μικροσκοπίου = 0,2 μm Με γυμνό μάτι μπορούμε να παρατηρήσουμε αντικείμενα από 100μm και άνω (π.χ.ωάρια, ορισμένα πρωτόζωα κ.λ.π.) Με το οπτικό μικροσκόπιο παρατηρούμε αντικείμενα από 0,2μm μέχρι 100μm (π.χ. Βακτήρια) Με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρατηρούμε αντικείμενα από 10Α ο έως περίπου 0,2μm

Μονάδες μέτρησης 1μm = m = 1 χιλιοστό του χιλιοστού 1nm = m = 1 χιλιοστό του μικρού 1Α ο = m = 1 δεκάκις χιλιοστό του μικρού

Το σύνθετο μικροσκόπιο είναι ένα οπτικό όργανο που χρησιμοποιείται για την παρατήρηση, υπό μεγέθυνση (έως και 1600x), αντικειμένων που βρίσκονται κοντά στον παρατηρητή. Αποτελείται από 4 βασικά στοιχεία: μια πηγή φωτός έναν συγκεντρωτικό φακό έναν αντικειμενικό φακό και έναν προσοφθάλμιο φακό

 Το σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο αποτελείται από δύο συγκλίνοντες φακούς, οι οποίοι βρίσκονται στον ίδιο οπτικό άξονα: τον αντικειμενικό, ο οποίος βρίσκεται κοντά στο παρατηρούμενο παρασκεύασμα και τον προσοφθάλμιο, ο οποίος βρίσκεται κοντά στο μάτι του παρατηρητή.  Το μήκος του σωλήνα του μικροσκοπίου έχει συνήθως σταθερό μήκος (τυπικά 160 mm).  Οι αντικειμενικοί φακοί που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι οι 10x,25x, 40x, και 90x ή 100x.  Οι αντικειμενικοί φακοί με μεγέθυνση 90x, 100x ονομάζονται καταδυτικοί. Για τη χρήση τους απαιτείται η προσθήκη ειδικού ελαίου (με υψηλό δείκτη διάθλασης)  Η αρχική μεγέθυνση οφείλεται στον αντικειμενικό φακό. Το παραγόμενο είδωλο μεγεθύνεται για δεύτερη φορά από τον προσοφθάλμιο φακό.

 Η ολική μεγέθυνση στο σύνθετο μικροσκόπιο είναι ίση με το γινόμενο των επιμέρους μεγεθύνσεων των δυο φακών.  Η μεγέθυνση ενός οπτικού μικροσκοπίου δίνεται από το τύπο: Μ = Μ1 x M2 όπου Μ1και M2 είναι οι μεγεθύνσεις των δυο φακών, δηλαδή του προσοφθάλμιου και του αντικειμενικού

Επομένως θα μπορούσαμε να πούμε ότι βάζοντας δυνατότερους φακούς θα ήταν δυνατό να πετύχουμε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις. Πράγματι θα βλέπαμε το παρασκεύασμά μας μεγαλύτερο χωρίς όμως να έχουμε πιο μεγάλη ευκρίνεια της εικόνας ("άδεια μεγέθυνση"), όπως ακριβώς συμβαίνει όταν μεγεθύνουμε πολύ μια φωτογραφία έτσι που να φαίνονται οι κόκκοι του film. Υπάρχει μ' άλλα λόγια μια μέγιστη χρήσιμη μεγέθυνση που είναι συνάρτηση της διακριτικής ικανότητας του οργάνου. Η μέγιστη χρήσιμη μεγέθυνση ενός οπτικού μικροσκοπίου υπολογίζεται ότι δε μπορεί να ξεπεράσει τα 1600x

Διάγραμμα των φακών και πορείας των φωτεινών ακτίνων στο οπτικό μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου.

Η προϋπόθεση για την καλή λειτουργία του μικροσκοπίου, είναι η κατά το δυνατόν ευθύγραμμη διαδρομή, χωρίς εκτροπή, της φωτεινής δέσμης από κάποιο σημείο του αντικειμένου ως τον αντικειμενικό φακό. Αυτό σημαίνει ότι ο συμπυκνωτής, το περιβάλλον του αντικειμένου και ο αντικειμενικός φακός έχουν περίπου τον ίδιο δείκτη διάθλασης. Η δίοδος των ακτίνων μέσα από στρώμα αέρα αυξάνει την εκτροπή των ακτίνων και εξασθενεί το είδωλο. Γι’ αυτό κάθε υλικό παρατηρείται μέσα σε σταγόνες νερού. Στην περίπτωση φακών μεγάλης ισχύος χρησιμοποιείται υγρό καταδύσεως με μεγάλο δείκτη διαθλάσεως, το οποίο παρεμβάλλεται ανάμεσα στο αντικείμενο και τον αντικειμενικό, ώστε να περιορίζεται η εκτροπή των ακτίνων (αύξηση διακριτικής ικανότητας). Το μικροσκόπιο μπορεί να συνδυαστεί με φωτογραφική μηχανή για τη φωτογράφηση μεγεθυσμένων εικόνων των αντικειμένων

Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (dark field). Αυτό το μικροσκόπιο είναι ίδιο με το φωτεινού πεδίου με μόνη διαφορά ότι στο συγκεντρωτή φακό υπάρχει ένας αδιαφανής δίσκος που σκεπάζει το κέντρο του φακού με αποτέλεσμα το παρασκεύασμα να φωτίζεται μόνο από πολύ πλάγιες ακτίνες. Έτσι η εικόνα που παρατηρούμε είναι φωτεινό αντικείμενο σε σκοτεινό πεδίο. Η πορεία των ακτινών φαίνεται στην εικόνα που ακολουθεί. Αυτό το είδος μικροσκοπίου συνιστάται για τη παρατήρηση μονοκύτταρων οργανισμών που θέλουμε να τους παρατηρήσουμε ζωντανούς ή/και αχρωμάτιστους.

Διάγραμμα της διάταξης των φακών και της πορείας των φωτεινών ακτίνων στο μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου.

Το μικροσκόπιο μπορεί να μετατραπεί σε μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου τοποθετώντας ένα μαύρο χάρτινο δίσκο ανάμεσα στην πηγή φωτός και το συμπυκνωτή

Τι πρέπει να προσέχουμε...  Το μικροσκόπιο πρέπει πάντα να σκεπάζεται όταν δεν χρησιμοποιείται.  Το μικροσκόπιο θα πρέπει πάντα να τοποθετείται σε στέρεο πάγκο εργασίας, σε χώρο που δεν υπάρχει πολύ σκόνη.  Το μικροσκόπιο πρέπει πάντα να μεταφέρεται από το βραχίονα (ακόμη καλύτερα ένα χέρι στο βραχίονα και ένα χέρι κάτω από τη βάση) και όχι για παράδειγμα από τους φακούς  Οι φακοί του μικροσκοπίου πρέπει να καθαρίζονται τακτικά με ειδικό χαρτί καθαρισμού φακών.  Μην ανοίγετε ποτέ τους φακούς. Είναι σχεδόν αδύνατον ένας φακός να έχει λερωθεί μέσα. Αυτό ισχύει κυρίως για τους αντικειμενικούς φακούς.  Οταν το μικροσκόπιο δε χρησιμοποιείται κλείνουμε τη φωτεινή πηγή!

Τι πρέπει να προσέχουμε... Ξεκινάμε πάντα την παρατήρηση με το φακό της μικρότερης μεγέθυνσης Αφαιρούμε την αντικειμενοφόρο πλάκα πάλι έχοντας σε θέση το φακό μικρότερης μεγέθυνσης για να αποφύγουμε τυχόν γδάρσιμο των φακών Εστιάζουμε πρώτα με το μακρομετρικό κοχλία και κάθε φορά που αλλάζουμε μεγέθυνση εστιάζουμε ξανά. Στη μεγάλη μεγέθυνση εστιάζουμε με το μικρομετρικό κοχλία Εάν δεν εστιάσουμε στη μικρή μεγέθυνση, δε θα μπορέσουμε να εστιάσουμε στη μεγαλύτερη Την καλυπτρίδα την τοποθετούμε υπό γωνία πάνω στην αντικειμενοφόρο και όταν έρθει σε επαφή με τη σταγόνα νερό, τότε την αφήνουμε να πέσει προσεκτικά για να μη δημιουργηθούν φυσαλίδες Τις αντικειμενοφόρους μπορούμε να τις πλύνουμε και να τις ξαναχρησιμοποιήσουμε

Χρωστικές  Οι χρωστικές είναι κατά κύριο λόγο, οργανικές ενώσεις, οι οποίες συνδέονται εκλεκτικά με τα διάφορα συστατικά ή οργανίδια του κυττάρου.  Κυριότερες χρωστικές: Lugol: είναι διάλυμα ιωδίου (1-2gr I και 4gr KI σε 100ml απιονισμένο H 2 O) Σε φυτικά και ζωικά κύτταρα και σε βακτήρια. Χρησιμοποιείται ως δείκτης αμύλου. Όταν το άμυλο ενώνεται με διάλυμα ιωδίου αποκτά ένα έντονο σκούρο μπλε χρώμα. Επίσης χρωματίζει και το κυτταρικό τοίχωμα που αποτελείται από πολυσακχαρίτες (κυτταρίνη). Επίσης χρησιμοποιείται στη χρώση κυττάρων κάνοντας τον πυρήνα του κυττάρου πιο ορατό. Μπλε του μεθυλενίου: χρωματίζει τα όξινα κυτταρικά μέρη (όπως ο πυρήνας) μπλε. Το κυτταρόπλασμα χρωματίζεται ασθενέστερα. Χρησιμοποιείται σε ζωικά κύτταρα (όπως επιθηλιακά κύτταρα στοματικής κοιλότητας), βακτήρια και αίμα Πράσινο του μεθυλίου: χρωματίζει τα σύμπλοκα πρωτεΐνη – DNA (1,9gr σκόνης πράσινο του μεθυλίου σε 95ml 50 0 λευκού οινοπνεύματος).

Υλικά Μικροσκόπιο Φυτικά υλικά για παρατήρηση στο μικροσκόπιο (κρεμμύδι, φύλλα κλπ) Αντικειμενοφόροι πλάκες Καλυπτρίδες Λαβίδα Βελόνα Νυστέρι ή μαχαίρι ή ξυραφάκι Νερό Σταγονόμετρο Τρυβλία Petri Διηθητικό χαρτί ή απορροφητικό χαρτί κουζίνας Χρωστικές Lugol Πράσινο του μεθυλίου

H Lugol είναι μία χρωστική που μπορεί να φτριαχτεί στο εργαστήριο: 1-2gr I και 4gr KI σε 100ml απιονισμένο H 2 O

Μικροσκοπική παρατήρηση φυτικών κυττάρων

Κόβουμε το κρεμμύδι και αποκολλάμε ένα λεπτό χιτώνα από το εσωτερικό του Διαδικασία

Τοποθετούμε ένα μικρό κομμάτι σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα και προσθέτουμε μία σταγόνα νερό Καλύπτουμε με μια καλυπτρίδα προσεκτικά για να μη δημιουργηθούν φυσαλίδες Σκουπίζουμε το επιπλέον νερό με το διηθητικό χαρτί Παρατηρούμε στο μικροσκόπιο

Σε δύο τριβλία petri τοποθετούμε από μία σταγόνα από χρωστικές (lugol και μπλε του μεθυλενίου ή πράσινο του μεθυλίου) Κόβουμε δύο ακόμη κομμάτια από το χιτώνα και τα τοποθετούμε πάνω στις σταγόνες. Ξεπλένουμε με νερό Τοποθετούμε το παρασκεύασμα σε μία αντικειμενοφόρο Ρίχνουμε μία σταγόνα νερό Καλύπτουμε με καλυπτρίδα Καθαρίζουμε το παρασκεύασμα Παρατηρούμε στο μικροσκόπιο

Τη χρωστική μπορούμε να τη βάλουμε και απευθείας πάνω στο δείγμα που έχουμε τοποθετήσει πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα το οποίο επίσης θα το ξεπλύνουμε με νερό ή Μπορούμε να καλύψουμε το δείγμα με μία καλυπτρίδα, να ρίξουμε μία σταγόνα χρωστική από τη μία πλευρά της καλυπτρίδας και από την άλλη να βάλουμε ένα διηθητικό χαρτί. Με αυτό τον τρόπο το διηθητικό χαρτί απορροφά το νερό και το νερό παρασύρει τη χρωστική

Εάν διαθέτουμε φωτογραφική μηχανή εγκατεστημένη πάνω στο μικροσκόπιο μπορούμε να βγάλουμε φωτογραφία τα παρασκευάσματά μας ή να περιηγηθούμε στο παρασκεύασμα

Χιτώνας κρεμμυδιού 4x

Χιτώνας κρεμμυδιού 10x

Χιτώνας κρεμμυδιού 40x

Χιτώνας κρεμμυδιού 4x μετά από χρώση με lugol

Χιτώνας κρεμμυδιού 10x μετά από χρώση με lugol

Χιτώνας κρεμμυδιού 40x μετά από χρώση με lugol

Χιτώνας κρεμμυδιού 4x μετά από χρώση με πράσινο του μεθυλίου

Χιτώνας κρεμμυδιού 10x μετά από χρώση με πράσινο του μεθυλίου

Μικροσκοπική παρατήρηση ζωικών κυττάρων Με το πλατύ μέρος μιας οδοντογλυφίδας παίρνουμε επιθήλιο από τη στοματική κοιλότητα τρίβοντας την εσωτερική επιφάνεια του μάγουλου Την οδοντογλυφίδα στη συνέχεια τη βουτάμε σε σταγόνα νερό που έχουμε τοποθετήσει πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Το επαναλαμβάνουμε 1 με 2 φορές Καλύπτουμε με μία καλυπτρίδα Παρατηρούμε στο μικροσκόπιο

Επιθηλιακά κύτταρα στοματικής κοιλότητας 4x

Επιθηλιακά κύτταρα στοματικής κοιλότητας 10x

Μικροσκοπικές φωτογραφίες από άλλα φυτικά κύτταρα

Υμένας επιφάνειας φύλλου 4x (στόματα)

Υμένας επιφάνειας φύλλου 10x (στόματα)

Υμένας επιφάνειας φύλλου 40x (στόμα)

Στόμα φύλλου από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης

Εγκάρσια τομή φύλλου 4x

Τομή μίσχου φύλλου 4x

Τομή φύλλου 4x dark field

Τομή φύλλου 10x

εφυμενίδα κολλέγχυμα άνω επιδερμίδα κάτω επιδερμίδα δρυφακτοειδές παρέγχυμα σπογγώδες παρέγχυμα καταφρακτικά κύτταρα ξύλωμα φλοίωμα στόμα εφυμενίδα Αγωγό σύστημα Τι περιμένουμε να δούμε...

Ε λασμα του φύλλου:  άνω και κάτω επιδερμίδα και  μεσόφυλλο που βρίσκεται ανάμεσά τους και διασχίζεται από το αγωγό σύστημα Ο κύριος ρόλος του φύλλου είναι η φωτοσύνθεση

Επιδερμίδα...  εξωτερικό στρώμα κυττάρων του φύλλου στενά συνδεδεμένων μεταξύ τους. Οι μόνοι μεσοκυττάριοι χώροι είναι τα στόματα. Εφυμενίδα:  Καλύπτει την επιδερμίδα (αποτελείται από υμενίνη) Περιορίζει την απώλεια ύδατος Αντανακλά μέρος της ηλιακής ακτινοβολίας (όπως και της υπεριώδους  προστασία DNA από μεταλλάξεις) Μη βιοαποικοδομήσιμη  προστασία από προσβολή μυκήτων και βακτηρίων Στην επιφάνεια της επιδερμίδας εναποτίθεται κηροί που συμβάλλουν στην προστασία των φυτών Κολλέγχυμα: κύτταρα με παχειά τοιχώματα Παρέχει μηχανική στήριξη στο φυτό

Μεσόφυλλο Στα κύτταρα του μεσόφυλλου πραγματοποιείται η φωτοσύνθεση. Το μεσόφυλλο αποτελείται από χλωροφυλλούχα κύτταρα, δηλαδή παρέγχυμα που διακρίνεται σε δύο τύπους: α) το δρυφακτοειδές, προς την πλευρά της επάνω επιδερμίδας, που αποτελείται από επιμήκη, σχεδόν κυλινδρικά κύτταρα, προσανατολισμένα κάθετα προς την επιφάνεια του φύλλου και πλούσια σε χλωροπλάστες και β) το σπογγώδες, προς την πλευρά της κάτω επιδερμίδας, που αποτελείται από κύτταρα με λίγους χλωροπλάστες, ακανόνιστου σχήματος, με μεγάλους μεσοκυττάριους χώρους. Αυξάνει την ευλυγισία του φύλλου. Η διάκριση μεταξύ σπογγώδους και δρυφακτοειδούς παρεγχύματος δεν είναι πάντοτε σαφής.

Το αγωγό σύστημα του φύλλου συγκροτείται από το ξύλωμα και το φλοίωμα

Θέση των στομάτων των φύλλων Τα στόματα είναι μικροσκοπικά ανοίγματα στην επιφάνεια των φύλλων που επιτρέπουν την ανταλλαγή αερίων κατά τις λειτουργίες της φωτοσύνθεσης, αναπνοής και διαπνοής. Ανάλογα με τη θέση των στομάτων τα φύλλα διακρίνονται: αμφιστοματικά φύλλα: και οι δύο επιδερμίδες φέρουν στόματα υποστοματικά φύλλα: τα στόματα περιορίζονται στην κάτω επιδερμίδα επιστοματικά φύλλα: τα στόματα περιορίζονται στην άνω επιδερμίδα  Τα επιπλέοντα φύλλα είναι επιστοματικά, ενώ τα βυθισμένα στερούνται στομάτων  Στα βελονοειδή φύλλα των κωνοφόρων τα στόματα είναι βυθισμένα και υπερκαλύπτονται από τα παραστοματικά κύτταρα  Τα ξηρόφυτα φέρουν στόματα βυθισμένα.

Στόματα των φύλλων Τα στόματα αποτελούνται από: Το στοματικό πόρο: φακοειδής μεσοκυττάριος χώρος Τα καταφρακτικά κύτταρα: εξειδικευμένα καταφρακτικά κύτταρα μεταξύ των οποίων αναπτύσσεται ο στοματικός πόρος Τα παραστοματικά ή βοηθητικά κύτταρα: διαφοροποιημένα επιδερμικά κύτταρα που εφάπτονται των καταφρακτικών Στα καταφρακτικά κύτταρα εντοπίζονται χλωροπλάστες, είναι όμως μικρότεροι από εκείνους του μεσόφυλλου.

Συνοπτικά (a) Φλοίωμα: μεταφέρει τα προϊόντα της φωτοσύνθεσης (b) Ξύλωμα: μεταφέρει νερό και θρεπτικά συστατικά από τις ρίζες στα φύλλα μέσω των μίσχων. (c) Επιδερμίδα: παράγει ένα κέρινο στρώμα για την προστασία από την απώλεια νερού. (d) Πασσαλώδες παρέγχυμα: η κύρια περιοχή φωτοσύνθεσης. (e) Σπογγώδες παρέγχυμα: παρέχει περιοχές για την κίνηση του νερού και των αερίων. (f) Κάτω επιδερμίδα: διαθέτει στόματα για την ανταλλαγή αερίων και τη διαπνοή.

Φύλλο Tradescantia Στόματα διατεταγμένα παράλληλα

καταφρακτικά παραστοματικά Φύλλο Tradescantia

Φύλλο Tradescantia (κινούμενη εικόνα)

Τομή μίσχου 4x

Οι κύριοι ιστοί που συναντώνται στους μίσχους τόσο των μονοκοτυλήδονων όσο και των δικοτυλήδονων φυτών είναι: Επιδερμίδα Φλοιός (παρεγχυματικά κύτταρα) Εντεριώνη (παρεγχυματικά κύτταρα) Αγωγός ιστός –ξύλωμα –φλοίωμα

Δικοτυλήδονα (Helianthus): ανατομία μίσχου Ο αγωγός ιστός σχηματίζει ένα κύλινδρο ή ένα δακτυλίδι από διακριτέςδεσμίδες. Κάθε δεσμίδα αποτελείται εξωτερικά από φλοίωμα και εσωτερικά από ξύλωμα. Ηθμαγγειώδης δεσμίδα εντεριώνη επιδερμίδα

Helianthus annus (ηθμαγγειώδης δεσμίδα) σκληρέγχυμα φλοίωμα Αγγεία ξυλώματος

Μονοκοτυλήδονα: ανατομία μίσχου Ο αγωγός ιστός αποτελείται από διάσπαρτες δεσμίδες με το ξύλωμα εσωτερικά και το φλοίωμα εξωτερικά. Asparagus Zea

Ζea mays – εγκάρσια τομή βλαστού Ηθμαγγειώδης δεσμίδα επιδερμίδα Χλωροφυλλούχο παρέγχυμα

Μύκητες 4x

Μύκητες 10x

Μύκητες 4x dark field

Μίσχος μπαμπού (SEM)

Christmas rose leaf (SEM)

Τομή φύλλου (SEM)

Πηγές 0field.jpg&imgrefurl= 0field.jpg&imgrefurl= click4biology.info/c4b/9/images/9.1/stemts.gif gif.phphttp:// gif.php Εισαγωγή στη Βοτανική (Γαλάτης Β., Αποστολάκος Π., Κατσαρός Χ.) Εκδόσεις Α. Σταμούλης