ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Μαρία Σάτρα Ε.ΔΙ.Π. Μοριακής Βιολογίας -Απομόνωση DNA -Ηλεκτροφόρηση DNA -PCR -Χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών στη Διάγνωση Βιολογία II:

Διαθέτετε τρεις μικροπιπέτες μl, μl και 2-20μl. Σας ζητείτε να μεταφέρετε τις ποσότητες 5,5μl, 300μl και 197μl ενός διαλύματος σε τρία διαφορετικά eppendorfs. Ποια μικροπιπέτα θα χρησιμοποιήσετε σε κάθε περίπτωση; Να γράψετε τη σωστή ένδειξη στην οθόνη κάθε πιπέτας ώστε να πάρουμε τους παραπάνω όγκους.

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Η απομόνωση βασίζεται στη χρησιμοποίηση στηλών που φέρουν φίλτρα/μεμβράνες από πηκτή σιλικόνης η οποία δεσμεύει εκλεκτικά νουκλεϊκά οξέα, ενώ είναι διαπερατή από πρωτεΐνες και δισθενή κατιόντα που μπορεί να αναστείλουν την DNA πολυμεράση κατά την αντίδραση PCR

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Το kit περιέχει: 1.Τις κατάλληλες στήλες, 2.Πρωτεϊνάση Κ, 3.το διάλυμα AL (διάλυμα λύσης), 4.Τα διαλύματα AW1 και AW2 (διαλύματα για τις εκπλύσεις απαιτείται αρχικά η προσθήκη αιθανόλης) και 5.Το διάλυμα ΑΕ (διάλυμα έκλουσης και επαναδιάλυσης του DNA).

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit 1-3:Λύση κυττάρων 1.Σε 200 μl δείγματος ( κύτταρα) προσθέτουμε 20 μl πρωτεϊνάση Κ 2.Προσθήκη 200 μl buffer AL, vortex για 15 sec 3.Τοποθέτηση στους 56 ο C για min υπό συνεχή ανάδευση

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit 4: αφυδάτωση DNA 4. Προσθήκη 200μl αιθανόλης (96-100%) Vortex

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Μεταφορά σε στήλες

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit 5: δέσμευση του αφυδατωμένου DNA στο φίλτρο 5. Φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 1min: δέσμευση του DNA στο φίλτρο

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit 6-10: καθαρισμός του φίλτρου 6. Μεταφορά της στήλης σε καθαρό σωληνάριο 7. Προσθήκη 500μl AW1 8. Φυγοκέντρηση στις rpm για 1min 9. Μεταφορά της στήλης σε καθαρό σωληνάριο 10. Προσθήκη 500μl AW2, φυγοκέντρηση στις rpm για 3min

ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit 11-13: ενυδάτωση φίλτρου/έκλουση DNA 11. Μεταφορά της στήλης σε καθαρό σωληνάριο 12. Προσθήκη μl απιονισμένο νερό 13.Φυγοκέντρηση στις rpm για 5min DNA

Συνοπτικά, η απομόνωση DNA με την χρήση στηλών

Για να πιστοποιήσουμε ότι απομονώσαμε DNA ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης……

ΟΜΑΔΑ A: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 21 PCR 21 DNA 22 PCR 22 DNA 23 PCR 23 M 200 bp DNA 28 PCR 28 DNA 31 PCR 31 DNA 32 PCR 32 DNA 28 M Μ: μάρτυρας

ΟΜΑΔΑ A: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 16 DNA 16 PCR 16 DNA 18 PCR 18 DNA 20 PCR 20 DNA24 PCR 24 M DNA 24 DNA 25 PCR 25 DNA 26 PCR 26 DNA 27 DNA 27 PCR 27 M M 200 bp Μ: μάρτυρας

ΟΜΑΔΑ B: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 50 PCR 50 DNA 51 PCR 51 DNA 52 PCR 52 DNA 56 PCR 56 M DNA 57 PCR 57 DNA 58 PCR 58 DNA 59 PCR 59 DNA 60 PCR 60 M 200 bp Μ: μάρτυρας

ΟΜΑΔΑ B: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 20 PCR 20 DNA 48 PCR 48 DNA 49 PCR 49 DNA 53 PCR 53 DNA 54 M PCR 54 DNA 55 PCR 55 DNA 61 PCR 61 DNA 62 PCR 62 DNA 30 PCR 30 M 200 bp Μ: μάρτυρας

DNA 1 PCR 1 DNA 2 PCR 2 DNA 3 PCR3 M DNA 9 PCR 9 DNA 11 PCR 11 DNA 12 PCR 12 DNA 13 PCR 13 M ΟΜΑΔΑ Γ: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR Μ: μάρτυρας 200 bp

ΟΜΑΔΑ Γ: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 4 DNA 4 PCR 4 DNA 5 PCR 5 DNA 8 PCR 8 M DNA 14 DNA 14 PCR 14 DNA 15 PCR 15 DNA 40 PCR 40 DNA 52 PCR 52 M 200 bp Μ: μάρτυρας

ΟΜΑΔΑ Δ: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 35 PCR 35 DNA 36 PCR 36 DNA 37 PCR 37 DNA 41 PCR 41 M DNA 42 PCR 42 DNA 43 PCR 43 DNA 46 PCR 46 M Μ: μάρτυρας 200 bp

ΟΜΑΔΑ Δ: ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ PCR DNA 6 PCR 6 DNA 33 PCR 33 DNA 34 PCR 34 DNA 38 PCR 38 DNA 39 PCR 39 M DNA 40 PCR 40 DNA 44 PCR 44 DNA 45 PCR 45 M 200 bp Μ: μάρτυρας

PCR Polymerase Chain Reaction….

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ DNA 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ primer 1 primer 2 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Πώς ακριβώς δουλεύει?

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Αποδιάταξη: 95 ºC cycle 1

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Υβριδοποίηση: 55 ºC cycle 1

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Επιμήκυνση: 72 ºC cycle 1

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Αποδιάταξη: 95 ºC cycle 2

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Υβριδοποίηση: 55 ºC cycle 2

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Επιμήκυνση: 72 ºC cycle 2

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Αποδιάταξη: 95 ºC cycle 3

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ Υβριδοποίηση: 55 ºC cycle 3

5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ Επιμήκυνση: 72 ºC cycle 3

In the late 1960's, Thermus aquaticus was first discovered in several springs in the Great Fountain area of the Lower Geyser Basin of Yellowstone National Park. It has since been found in thermal habitats throughout the world. Its temperature range is about degrees C ( degrees F), and its optimum is around 70 degrees C (158 degrees F). Purification of DNA polymerase from Thermus aquaticus was key to the development of PCR Photos © 1994 Yellowstone Association for Natural Science, History & Education, Inc. Yellowstone National Park, Wyoming The hot spring in which Taq was first discovered

The bacterium is Thermus aquaticus:

Η DNA πολυμεράση του Thermus aquaticus ονομάζεται Taq για συντομία Δεν κατστρέφεται στους 94ºC Δρα ιδανικά στους 72ºC

1 ATTTAATTAT GGCCGATTCG TGCGCGGAAA ATGCCGCCAA AGGGACGGAA 51 AATGAGCGGC CGAAGAAGTG GAGGCCAGCG CCGACACCGT CCCACAGGTG 101 GAGGAGGGCG TAGAGGAGTA TTTGAAGCGT AAGAACATGG TCCTCCTCGA 151 CTACGAAAAG CAAATGTTTC TCGATTTGGT CGAGGCCGAT GGTCTGCTGG 201 TTTGCGCCAA GGGCCTGAGC TACGACCGCG TTGTAATCAG CATCCTCAAG 251 GCCTACAGCG ATTCCGGCAA TCTTGTGCTT GTGATCAACA GTTCTGACTG 301 GGAGGAGCAG TATTACAAGT CCAAAATCGA ACCCAAATAT GTCCACGAAG 351 GTGCCAGCAC GGCCACCGAA AGAGAGCGCG TTTATCTGGA AGGCGGGCTG 401 CAGTTCATTA GCACGCGCAT CCTGGTGGTG GATCTGCTCA AGCAGCGAAT The DNA sequence of the coding strand for a gene is shown below. The number on each line corresponds to the position of the first nucleotide on that line. PCR is performed using the primers 5'-GCCCGCCTTCCAGATAAAC-3' and 5'-GCGGAAAATGCCGCCAAA -3'. What is the expected size of the product?

1 GCGGAAA ATGCCGCCAA AGGGACGGAA 51 AATGAGCGGC CGAAGAAGTG GAGGCCAGCG CCGACACCGT CCCACAGGTG 101 GAGGAGGGCG TAGAGGAGTA TTTGAAGCGT AAGAACATGG TCCTCCTCGA 151 CTACGAAAAG CAAATGTTTC TCGATTTGGT CGAGGCCGAT GGTCTGCTGG 201 TTTGCGCCAA GGGCCTGAGC TACGACCGCG TTGTAATCAG CATCCTCAAG 251 GCCTACAGCG ATTCCGGCAA TCTTGTGCTT GTGATCAACA GTTCTGACTG 301 GGAGGAGCAG TATTACAAGT CCAAAATCGA ACCCAAATAT GTCCACGAAG 351 GTGCCAGCAC GGCCACCGAA AGAGAGCGCG TTTATCTGGA AGGCGGGC The DNA sequence of the coding strand for a gene is shown below. The number on each line corresponds to the position of the first nucleotide on that line. PCR is performed using the primers 5'-GCCCGCCTTCCAGATAAAC-3' and 5'-GCGGAAAATGCCGCCAAA -3'. What is the expected size of the product? PCR product = =

1 ATTTAATTAT GGCCGATTCG TGCGCGGAAA ATGCCGCCAA AGGGACGGAA 51 AATGAGCGGC CGAAGAAGTG GAGGCCAGCG CCGACACCGT CCCACAGGTG 101 GAGGAGGGCG TAGAGGAGTA TTTGAAGCGT AAGAACATGG TCCTCCTCGA 151 CTACGAAAAG CAAATGTTTC TCGATTTGGT CGAGGCCGAT GGTCTGCTGG 201 TTTGCGCCAA GGGCCTGAGC TACGACCGCG TTGTAATCAG CATCCTCAAG 251 GCCTACAGCG ATTCCGGCAA TCTTGTGCTT GTGATCAACA GTTCTGACTG 301 GGAGGAGCAG TATTACAAGT CCAAAATCGA ACCCAAATAT GTCCACGAAG 351 GTGCCAGCAC GGCCACCGAA AGAGAGCGCG TTTATCTGGA AGGCGGGCTG 401 CAGTTCATTA GCACGCGCAT CCTGGTGGTG GATCTGCTCA AGCAGCGAAT The DNA sequence of the coding strand for a gene is shown below. The number on each line corresponds to the position of the first nucleotide on that line. PCR is performed using the primers 5'-GTTTATCTGGAAGGCGGGC-3' and 5'-GCGGAAAATGCCGCCAAA -3'. What is the expected size of the product? No PCR product!

Polymerase Chain Reaction (PCR)

After 1 cycle copies double After 2 cycles copied doubled and new strand is unit length (goes only from primer to primer) Polymerase Chain Reactio

Polymerase Chain Reaction After 3 cycles copies are increased 8-fold and new copies are ds and unit length Odd length copies increase arithmetically Unit length copies increase in number geometrically

Polymerase Chain Reaction By completion of cycles nearly all copies are ds DNA and unit length products

extraction/ UDXOpZHWzljAyiq3aYFq1phXXISraz8e6XJ13OzvRNDVJHV2jlru9q4 YjjkRTGcTH6iHx5kJwy2853OB_q3FR3KLHToge3SEFAA9gvJiXRrxh 8uAErLRPlL8Gi- FUQ0JF6lZSzEV82AD3eWttGM4RF0DqyzCA/ /?ty pe=2&opaqueCursor=AbpZ29Cvac7jbv0ZG4dcu5bCMtb29HKtllEM2_ Rc4qNeXHVU03e169br7J-gtS- _rVEHgV_hrD6DFaRTozeU1Y6NpAFpGMIqcS6jIBitIYJTjtr4BMBUlhJ 1yfFPFakEAsFdsv8c1onfS4md5f7Mdpdr3penaGvif8WL_q0QyaTERJ h14j7jJE38_VWHxCnBaCeWQITzHwzLO0cK- o46idvSMDsS1U_HVsZMeAIq9mTAZATRttPlLoJD374RhQJwfvdEkJ5 4br74NFTXwYqjP8CwVpx70rtF6x2MrUhNMhJucl4orRjI2- kIKKfT6A1OFr6rDV56dZwoJwi4vBo3DzBG&theater

Συχνά μία μεταλλαγή στην αλληλουχία DNA μπορεί είτε να αναιρέσει τη θέση κοπής μιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης αλλάζοντας την αλληλουχία αναγνώρισής της είτε να δημιουργήσει μία θέση κοπής για κάποια ένζυμο. Η ιδιότητα αυτή χρησιμοποιείται συχνά για την ανίχνευση κάποιας μεταλλαγής.

Η μεταλλαγή IVSII-745 (C  G) του β-γονιδίου σφαιρίνης συνίσταται σε αλλαγή της φυσιολογικής βάσης C που υπάρχει στο νουκλεοτίδιο 745 του δεύτερου εξωνίου, σε G. Η μεταλλαγή αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία φαινοτύπου β-θαλασσαιμίας. Η αλλαγή στην αλληλουχία από CTAC σε GTAC δημιουργεί αλληλουχία αναγνώρισης για την περιοριστική ενδονουκλεάση Rsa I. Ύπαρξη της μεταλλαγής IVSII-745 οδηγεί σε πέψη του προϊόντος PCR, μετά από την επώασή του με το ένζυμο Rsa I, σε δύο τμήματα DNA μήκους 350 και 200 νουκλεοτιδίων αντίστοιχα. Το αποτέλεσμα της επώασης στις θέσεις 7 και 9 μας οδηγεί στο συπέρασμα ότι τα αντίστοιχα άτομα είναι ομόζυγα για την παραπάνω μεταλλαγή, ενώ το άτομο που αντιστοιχεί στη θέση 8 είναι ετερόζυγο. DNA PCR πέψη 100bp bp 350 bp 200 bp

Η μεταλλαγή IVSII-745 (C  G) του β-γονιδίου σφαιρίνης συνίσταται σε αλλαγή της φυσιολογικής βάσης C που υπάρχει στο νουκλεοτίδιο 745 του δεύτερου εξωνίου, σε G. Η μεταλλαγή αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία φαινοτύπου β-θαλασσαιμίας. Η αλλαγή στην αλληλουχία από CTAC σε GTAC καταργεί αλληλουχία αναγνώρισης για την περιοριστική ενδονουκλεάση Rsa I. Απουσία της μεταλλαγής IVSII-745 οδηγεί σε πέψη του προϊόντος PCR, μετά από την επώασή του με το ένζυμο Rsa I, σε δύο τμήματα DNA μήκους 350 και 200 νουκλεοτιδίων αντίστοιχα. Το αποτέλεσμα της επώασης στις θέσεις 7 και 9 μας οδηγεί στο συπέρασμα ότι τα αντίστοιχα άτομα είναι ομόζυγα για το φυσιολογικό γονίδιο, ενώ το άτομο που αντιστοιχεί στη θέση 8 είναι ετερόζυγο. DNA PCR πέψη 100bp bp 350 bp 200 bp